SMS1-SM通过调控B细胞功能参与SLE疾病进展的作用机制研究

发布时间：2020-07-04 16:27

【摘要】：目的:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种以自身抗体产生和多器官受损为特征的自身免疫性疾病,其病理机制的核心是机体对自身抗原的免疫耐受打破,大量针对自身抗原的B细胞过度活化并分泌大量自身抗体。而导致B细胞功能异常的具体机制仍不清楚。脂筏(Lipid Rafts,LRs)是细胞膜中富含胆固醇和鞘磷脂(Sphingomyelin,SM)的功能微区,可以参与淋巴细胞的活化、信号转导等多种生物学功能。鞘磷脂合成酶1(Sphingomyelin synthase 1,SMS1)是SM合成的关键酶,近年来随着对脂质的研究,其多种生物学功能逐渐被发现。探讨SMS1-SM在B细胞活化中的作用有望为SLE探寻新的干预靶点提供依据,因此本研究旨在阐明SMS1-SM在B细胞功能及SLE疾病进展中的作用及机制。方法:1.纳入性别及年龄匹配的SLE患者及正常志愿者,磁珠分选获得SLE患者及正常志愿者外周循环的B淋巴细胞,RT-PCR技术分析B细胞SMS1的mRNA表达水平,CBA法检测纳入者血清细胞因子谱的水平,将以上指标与其他实验室检查、疾病活动度评分进行相关性分析。2.磁珠分选获得SMS1-/-和WT小鼠脾脏B淋巴细胞,进行体外刺激活化,流式细胞术检测B细胞的活化、增殖及分化水平,Western Blot检测BCR活化时下游信号通路中关键蛋白分子的磷酸化水平。3.以Bm12小鼠作为供者小鼠,将性别和年龄匹配的SMS1-/-和WT小鼠分别作为受者,构建cGVHD模型以模拟SLE的病理状态。造模前以及造模后每2周收集小鼠的血清标本及尿标本。在诱导4周后,ELISA检测小鼠血清ANA的滴度,比色法检测小鼠尿肌酐水平,BCA法检测小鼠尿蛋白的水平;同时流式细胞术评估小鼠脾脏B淋巴细胞的活化状态。另外,磁珠分选得到WT小鼠脾脏来源的功能正常的B细胞,分别对SMS1-/-和WT小鼠进行尾静脉过继转输,转输后再进行cGVHD模型的诱导,观察以上指标的变化。4.利用pristane腹腔注射对SMS1-/-和WT小鼠诱导SLE模型,造模周期为6个月,评估SMS1缺陷对模型小鼠自身抗体滴度、肾脏病理损伤及评分、IgG沉积及B细胞活化功能的影响。结果:1.SLE患者B淋巴细胞SMS1mRNA表达水平显着升高,与血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-12和IL-23均呈显著正相关;同时研究发现SMS1 mRNA水平与血清IgG和球蛋白滴度也有显著的正相关性,但与SLEDAI评分没有明显的相关性。2.SMS1-/-小鼠脾脏B淋巴细胞在体外刺激活化后,其CD69、CD80和CD86的表达显著低于WT组,但细胞表面GM1的水平与WT组没有显著差异;同时SMS1-/-的B细胞的BCR信号通路中Fyn和Syk的磷酸化水平明显弱于WT组;此外,SMS1-/-B细胞的增殖和分化水平也受到抑制。3.Bm12诱导的cGVHD模型在造模4周后,SMS1-/-小鼠血清ANA滴度和24小时尿蛋白排泄量显著低于WT组,其脾脏B细胞上CD69、CD80和CD86的表达低于WT组。而SMS1-/-小鼠在过继转输功能正常的B细胞后再进行cGVHD模型的诱导,可以加剧血清中ANA和24小时尿蛋白的产生,同时B细胞的活化也得到部分纠正。4.在pristane诱导的SLE模型中,同样发现SMS1缺陷可以显著降低自身抗体ANA、anti-dsDNA的滴度,降低肾脏的病理评分及IgG的沉积,而SMS1-/-组模型疾病表现的改善同样与抑制B细胞过度活化相关。结论:SMS1是参与B淋巴细胞活化的重要组分,可以通过影响B细胞的功能参与SLE的疾病进展,有望成为SLE治疗的新的潜在靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.241
【图文】：

磁珠分选外周血中B细胞，流式检测B细胞纯度

图 3：SLE 患者于正常对照组（HC）血浆中细胞因子的水平。CBA 方法检测纳入者血清中 IL-1β、IFN-α、IFN-γ、TNF-α、CCL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 和 IL-23 的表达水平，N(SLE)=21，N(HC)=15。三、 SMS1mRNA、细胞因子与实验室指标及疾病活动度 SLEDAI 评分之间的相关性分析。1. B 细胞 SMS1 的表达水平与细胞因子谱的相关性分析SLE 患者血浆或血清中存在多种细胞因子水平的异常，已有的研究指出 IFN-α、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 和 IL-23 等细胞因子均可能存在异常，虽然部分研究的结果及结论并非一致，但目前多数学者认为细胞因子的水平可以一定程度地反映疾病的活动状态。

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本文编号：2741310