miR-125b-5p在UVB影响SLE自噬中的作用机制

发布时间：2020-07-09 09:58

【摘要】：[目的]检测中波紫外线对Jurkat细胞和系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞自噬水平和miRNA表达的影响;筛选miR-125b-5p的下游靶基因并鉴定;调控miR-125b-5p及其下游靶基因的表达后检测中波紫外线照射对细胞自噬水平的影响,以探索中波紫外线通过自噬通路在系统性红斑狼疮疾病过程中的作用,以及差异性表达的miRNA在此过程中的作用和调控机制。[方法]1.使用0-200mj/cm2的中波紫外线对Jurkat细胞进行照射,于照射后12h、24h、48h通过Western-blotting、qPCR、激光共聚焦显微镜检测自噬信号通路标志激活基因(微管相关蛋白1轻链3、Beclin-1)和miR-125b-5p的表达水平。2.使用50mj/cm2的中波紫外线照射系统性红斑狼疮患者和正常人的外周血单个核细胞,24h后通过Western-blotting、qPCR检测自噬信号通路标志激活基因(微管相关蛋白1轻链3、Beclin-1)的表达水平;通过高通量测序(RNA-seq)和miRNA芯片技术对差异性表达的mRNA和miRNA进行筛选,并使用Western-blotting、qPCR进行鉴定。3.使用生物信息学的方法寻找miR-125b-5p与自噬通路相关的下游靶基因,通过Western-blotting、qPCR检测其在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中的表达情况。转染miR-125b-5p的激动剂/胎抗剂后通过Western-blotting、qPCR检测对靶基因表达的影响,共转染miR-125b-5p的模拟物和荧光素酶报告基因载体后通过检测荧光素酶的比值以确认miR-125b-5p对靶基因3'UTR的作用靶点。4.使用miR-125b-5p的激动剂/拮抗剂、紫外线照射抵抗相关基因的过表达载体/小干扰RNA转染Jurkat细胞并照射中波紫外线后,通过Western-blotting、qPCR、激光共聚焦显微镜检测自噬通路基因(微管相关蛋白1轻链3、Beclin-1、自噬相关基因7、紫外线照射抵抗相关基因)的表达变化。[结果]1.当中波紫外线照射剂量小于50mj/cm2时,随剂量的增加,自噬水平逐渐升高;当中波紫外线照射剂量大于50mj/cm2时,随剂量的增加,自噬水平逐渐降低;50mj/cm2剂量组的自噬水平最高。2.当照射剂量小于50mj/cm2时miR-125b-5p的水平与照射剂量呈负相关,而当照射剂量大于50mj/cm2时miR-125b-5p的水平与照射剂量呈正相关,当照射剂量为50mj/cm2时miR-125b-5p的表达水平最低。3.在未暴露于中波紫外线时,系统性红斑狼疮患者和正常对照的外周血单个核细胞内自噬标志基因(Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3 II、自噬相关基因7、紫外线照射抵抗相关基因)的水平无明显差别;在暴露于中波紫外线后,系统性红斑狼疮患者的外周血单个核细胞内自噬标志基因(Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3 II、自噬相关基因7、紫外线照射抵抗相关基因)的水平显著上升,而正常对照则无明显变化。4.在未暴露于中波紫外线的情况下,系统性红斑狼疮患者的外周血单个核细胞中miR-125b-5p的表达水平较正常对照组低;暴露于中波紫外线后系统性红斑狼疮患者和正常对照的外周血单个核细胞中miR-125b-5p的表达均较未暴露时降低,系统性红斑狼疮-中波紫外线组的miR-125b-5p表达水平最低。5.过表达miR-125b-5p可以降低紫外线照射抵抗相关基因的表达,抑制miR-125b-5p可以提高紫外线照射抵抗相关基因的表达;miR-125b-5p通过与紫外线照射抵抗相关基因的3'UTR互补序列结合,下调紫外线照射抵抗相关基因的mRNA和蛋白表达。6.下调miR-125b-5p的表达或上调紫外线照射抵抗相关基因的表达可以提高Jurkat细胞的自噬水平;上调miR-125b-5p的表达或下调紫外线照射抵抗相关基因的表达可以降低Jurkat细胞的自噬水平。[结论]中波紫外线可以诱发Jurkat细胞自噬和改变miR-125b-5p的表达水平,其效应与照射剂量有关。中波紫外线通过下调系统性红斑狼疮患者的外周血单个核细胞内miR-125b-5p的表达水平,上调紫外线照射抵抗相关基因的表达,从而促进细胞自噬。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.241
【图文】：

内普遍存在的基本生理活动。自噬异常已被证实与很多疾病的发生、发展密切相逡逑关［１２］。自噬激活时，形成双层膜的囊泡，包裹细胞质内的部分蛋白质和细胞器逡逑形成自噬泡，随后和溶酶体结合使自噬泡内物降解和再利用（图１）邋［１３？］。现在逡逑普遍认为自噬是细胞对外来性的创伤防御和应激调控的重要机制。通过自噬作用逡逑和溶酶体结合，细胞得以消除损伤的线粒体、错误折叠的蛋白质和某些病原体。逡逑当面临氧化应激、饥饿、电离辐射等应激情况下，激活自噬通路，同时对细胞内逡逑的多种信号途径进行调控，从而达到稳定细胞内环境等目的［１５］。逡逑’逦广、逦Ｐｌａｓｍａ￣￣逡逑Ｔ逦ｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑Ｌｙｓｏｓｏｍｅ邋ｆ邋Ｔ逡逑Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ邋（ＡＰ）邋ｌ逡逑５）邋Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ：邋ｎｏｎｎａｌ邋ｆｌｕｘ邋＊逡逑？邋Ｊｊ逦Ａｕｔｏｌｙｓｏｓｏｍｅ邋（ＡＬ）逡逑Ｃｙｔｏｐｌａｓｍ逡逑图１．巨自噬的过程示意图。逡逑自噬在免疫和炎症性疾病中的作用近年来开始引起了学者们的注意。自噬是逡逑细胞器转换所必需的内源性过程，维持细胞内稳态并影响细胞的命运。自噬调节逡逑的改变和各种风湿性疾病的进展有关，包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、逡逑骨关节炎和系统性硬化症［１６］。全基因组相关性研宄显示，ＳＬＥ的发病与某些自逡逑噬通路基因（ＰＲＤＭ１，ＤＲＡＭ１，ＭＡＰ１ＬＣ３Ｂ，ＡＴＧ５）的多态性密切相关［１７＿２１］。逡逑ＳＬＥ患者可能存在对以下过程的调节缺陷：干扰素和前炎症细胞因子分泌、树突逡逑状细胞抗原提呈作用、垂死细胞清除等［２２］。与正常小鼠和正常人群相比

将处于不同生长期的培养Ｊｕｒｋａｔ细胞置于倒置显微镜下观察，可见Ｊｕｒｋａｔ逡逑细胞外观呈圆形，细胞膜折光度强，悬浮于培养基中，成团生长，至对数生长期逡逑时成团更明显（图２）。逡逑＿ｔ＿逡逑图２．邋Ｊｕｒｋａｔ细胞的显微镜下外观（ｘ２００）。（Ａ）细胞融合度为２０％？３０％逡逑时，可见少量细胞团。（Ｂ）细胞融合度为７０－８０％时，可见大量细胞团，细胞进逡逑入对数生长期。逡逑２逦ＲＦＰ－ＬＣ３邋Ｊｕｒｋａｔ细胞系的形态学观察逡逑使用倒置荧光显微镜观察经ＲＦＰ－ＬＣ３慢病毒毒液感染后４８小时的Ｊｕｒｋａｔ细逡逑胞，可见细胞外观呈圆形，细胞膜折光度强，悬浮于培养基中，成团生长，红色逡逑荧光蛋白表达率约为２０％？４０％。细胞外形较未感染时无明显变化，可继续用于逡逑后续实验（图３）。逡逑３１逡逑

可见细胞外观呈圆形，细胞膜折光度强，悬浮于培养基中，成团生长，红色逡逑荧光蛋白表达率约为２０％？４０％。细胞外形较未感染时无明显变化，可继续用于逡逑后续实验（图３）。逡逑３１逡逑

【参考文献】

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1 曾芙蓉;徐倩云;刘

本文编号：2747303