细胞自噬在氟诱导成釉细胞凋亡中的作用

发布时间：2020-07-11 01:00

【摘要】：目的:研究细胞自噬在氟诱导成釉细胞凋亡中的作用。方法:体外培养小鼠成釉细胞系(LS8)。1.用Na F(0 m M、0.25 m M、0.5 m M、1 m M、2 m M、4 m M)分别处理细胞24 h、48 h和72 h:CCK8检测各浓度对细胞增殖的影响。2.用Na F(0 m M、0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)作用细胞24h:○1 DAPI染色观察细胞核形态改变;○2流式细胞术检测细胞凋亡率。3.设置正常对照组,及实验分组Na F(0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)组,处理24 h后:○1实时荧光定量PCR(q RT-PCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)检测自噬相关基因LC3II,Beclin-1的表达水平;○2免疫荧光检测LC3II胞内定位。4.设置正常对照组,阳性对照组Na F(1.6 m M)及实验组Na F+3-MA(5 m M/10 m M/15 m M)组:○1 q RT-PCR及Western blot检测自噬相关基因LC3II,Beclin-1的表达水平;○2 DAPI染色观察细胞核形态改变;○3流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.Na F能呈剂量和时间依赖性抑制LS8细胞的生长,其半数抑制浓度(IC50)是1.59 mmol/L;DAPI染色提示:对照组细胞核完整,染色质均一、无局部聚集。Na F干预组细胞核固缩,染色质不均,并有细胞核碎片,Na F浓度越高,核固缩程度及细胞核碎片越多。2.Na F(0 m M、0.8 m M、1.2 m M、1.6 m M、3.2 m M)处理LS8细胞24 h,其凋亡率分别是(2.267±0.27)%、(6±0.5)%、(15.7±2.4)%、(43.8±0.58)%,(64.63±0.38)%,表明细胞凋亡率随着Na F浓度的增高而增高(P0.01)。3.Na F实验组处理24 h后与正常对照组相比,LS8细胞中LC3II与Beclin-1的转录与翻译水平随着Na F浓度的增高而增高,在Na F(1.6 m M)时达到高峰(P0.01),在Na F(3.2 m M)时下降(P0.01);免疫荧光示:正常对照组LC3II细胞质内低水平表达,胞浆内呈均匀的微弱绿色荧光,Na F(1.6 m M)组细胞胞质内荧光点数量及强度明显强于对照组,且胞质中出现聚集荧光斑点。4.Na F+3-MA(5 m M、10 m M、15 m M)处理细胞24 h后,与Na F(1.6 m M)组相比,LS8细胞中LC3II与Beclin-1的转录和翻译水平明显降低;DAPI染色提示:对照组细胞核完整,无局部致密浓染。Na F干预组出现细胞核固缩,染色质聚集和细胞核碎片,Na F和3-MA联用组对比空白组和Na F干预组,核固缩程度及细胞裂解增多明显;正常对照组细胞凋亡率为(2.27±2.27)%,Na F(1.6 m M)组细胞凋亡增加,凋亡率为(43.8±0.58)%,Na F+3-MA(5 m M、10 m M、15 m M)组凋亡率分别为(55.17±0.22)%、(61.3±0.53)%、(78.4±0.85)%。结论:过量氟能抑制成釉细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,该作用与细胞的自噬水平有关,Na F超过一定浓度后,细胞的自噬作用降低,或用3-MA抑制其自噬反应后,细胞凋亡增加,表明成釉细胞内的自噬有抗凋亡作用,细胞自噬在氟化物对成釉细胞的损伤中起到了一定的保护作用。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R781.2;R599.1
【图文】：

细胞增殖,半数抑制浓度,成釉细胞,细胞

图 1 成釉细胞系 LS8 细胞镜下观察细胞增殖和凋亡的影响釉细胞增殖的影响0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM）分别测不同浓度的 NaF 对细胞增殖的影响。结果显殖抑制作用越强。NaF 浓度低于 0.5 mM 时，对度上升到 2 mM 时，对细胞增殖的抑制大于 50 NaF作用于LS8细胞24 h后，其半数抑制浓度（IC

成釉细胞,细胞,细胞增殖,半数抑制浓度

图 1 成釉细胞系 LS8 细胞镜下观察NaF 对成釉细胞增殖和凋亡的影响1 NaF 对成釉细胞增殖的影响NaF（0 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM、2 mM、4 mM）分别处理 LS8 ，用 CCK8 检测不同浓度的 NaF 对细胞增殖的影响。结果显示：随着 N高，对细胞增殖抑制作用越强。NaF 浓度低于 0.5 mM 时，对细胞的抑制0.01）；当浓度上升到 2 mM 时，对细胞增殖的抑制大于 50 % (P<0.05)，制程度增强。NaF作用于LS8细胞24 h后，其半数抑制浓度（IC50）为1.59 m

细胞核,小体,固缩,染色质

图 3 NaF 不同浓度下 24 h、48 h、72 h 对细胞增殖抑制的影响注：*、#、+或**、##、++分别表示与对照组相比 P<0.05 或 P<0.01釉细胞核形态变化浓度 NaF 作用 LS8 细胞 24 h 后，通过荧光显微镜观察发现，对照，无缺损，为椭圆形，呈浅蓝色，染色质均一；0.8 mM 组有少量，荧光变强；1.2 mM 组细胞核固缩数量较前组增多，少量细胞核色；1.6 mM 组与 3.2 mM 组细胞核固缩与细胞核裂解碎片较低浓现大小不等的圆形小体（凋亡小体），且 3.2 mM 组较 1.6 mM 组亡小体增多，染色质聚集更加明显。表明随着 NaF 浓度的增高对重（图 4）。

【参考文献】