凋亡和自噬流紊乱在高碘致SD大鼠神经毒性中的作用研究

发布时间：2020-07-12 04:57

【摘要】：目的:碘是人体所必需微量元素之一,但人体碘摄入过量会导致许多疾病。大量的研究表明,摄入高碘可损害甲状腺的结构和功能,引发很多甲状腺疾病。近年来,高碘对智力的不利影响正受到越来越多的关注,但高碘与神经毒性之间的关系存在争议。本研究通过模拟人群高碘暴露方式构建的大鼠高碘饮水染毒模型探讨高碘摄入是否会导致神经毒性及凋亡和自噬在其中的作用。方法:选择36只健康成年SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄比为2:1,体重210~250 g。各性别的大鼠被随机分成4组:1个对照(自来水)组和3个碘酸钾(Potassium iodate,KIO_3)染毒组(500、2 500、5 000μg/L KIO_3)。大鼠自由饮水进食。将各组大鼠按雌雄比2:1合笼配对,将孕鼠放置在单独的笼子中,并保持染毒方式和剂量不变至仔鼠断乳(出生后第21天)。断乳后将亲代和子代分开,从每组随机挑选10只雌性仔鼠,保持染毒方式和剂量不变至仔鼠出生后第4个月末。定期记录大鼠的体重。应用砷铈催化分光光度法检测4月龄雌鼠尿碘浓度,应用Morris水迷宫实验(MWM)检测4月龄雌鼠的学习能力和记忆能力,应用尼氏染色(Nissl staining)检测4月龄雌鼠的海马组织病理结构变化,应用透射电子显微镜(TEM)检测4月龄雌鼠海马组织超微结构的变化,应用检测DNA断裂碎片的原位末端标记实验(TUNEL)检测4月龄雌鼠海马组织细胞的凋亡情况,应用蛋白免疫印迹试验(Western blot)和免疫组化实验(IHC)检测凋亡关键分子Caspase-3、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(PARP)、肿瘤抑制基因蛋白P53、B淋巴细胞瘤基因-2蛋白(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)、细胞色素C(Cyt c)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白轻链3-β(LC3)、自噬体形成关键蛋白Atg7和Beclin1、自噬选择性底物蛋白P62的表达水平。结果:KIO_3暴露4个月后,尿碘检测结果显示,3个KIO_3染毒组4月龄雌鼠尿碘浓度明显比对照组高(P0.05)。体重结果显示各组4月龄雌鼠体重无显著差异,但3个KIO_3染毒组雌鼠的脑组织脏器系数显著低于对照组(P0.05)。水迷宫前4天的定位航行实验(PNT)结果表明各组4月龄雌鼠的逃避潜伏期在第2-4天,3个KIO_3染毒组的4月龄雌鼠逃避潜伏期均长于对照组(P0.05);在第2-4天,3个KIO_3染毒组4月龄雌鼠游离固定平台的距离均长于对照组(P0.05)。第5天的空间探索实验(SPT)结果显示,2500和5000μg/L KIO_3染毒组的4月龄雌鼠平台穿越次数显著低于对照组(P0.05);与对照组相比,2500和5000μg/L KIO_3染毒组的4月龄雌鼠在目标象限中花费的游泳时间/游泳距离和总的游泳时间/游泳距离的百分比显著降低(P0.05)。尼氏染色结果显示,各KIO_3染毒组4月龄雌鼠尼氏体数量显著低于对照组(P0.05),并且随着KIO_3染毒剂量的升高,4月龄雌鼠海马CA3区中观察到甲苯胺蓝染色的尼氏体呈现逐渐减少的趋势。TEM检测结果表明,与对照组相比,3个KIO_3染毒组4月龄雌鼠海马超微结构显示出多种异常特征,包括核染色质的均质化和边缘化,线粒体损伤(肿胀、膜以及嵴的消失),内质网扩张,出现许多自噬体和神经纤维的脱髓鞘改变。TUNEL试验检测结果显示2500和5000μg/LKIO_3染毒组的4月龄雌鼠海马CA3区TUNEL阳性发生率显著高于对照(P0.05),并且随着染毒剂量的升高阳性率也呈现升高的趋势。Western blot和IHC结果显示,与对照组相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒组4月龄雌鼠海马中凋亡相关蛋白PARP,P53和Cleaved caspase-3蛋白的表达水平显著升高(P0.05);此外,与对照组相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒组海马中线粒体凋亡相关蛋白Bax和Cyt c蛋白的表达水平显著升高(P0.05),而2500和5000μg/L KIO_3染毒组4月龄雌鼠海马中线粒体凋亡相关蛋白Bcl2蛋白的表达水平显著下降(P0.05);与对照组相比,2500和5000μg/LKIO_3染毒组4月龄雌鼠海马中自噬形成关键蛋白Atg7、Beclin1和自噬体标志蛋白LC3-II表达水平均显著升高(P0.05),2500和5000μg/LKIO_3染毒组4月龄雌鼠海马中自噬底物蛋白p62表达水平也显著升高(P0.05)。结论:高碘暴露会导致4月龄雌鼠的学习能力和记忆能力下降,损伤大鼠海马组织结构。同时,高碘暴露会导致大鼠海马发生凋亡和自噬流紊乱;线粒体凋亡途径参与了高碘诱导的细胞凋亡,而自噬流紊乱是由自噬体形成的增加和降解的减少所诱导。综上,凋亡和自噬流紊乱参与了高碘致SD大鼠神经毒性的损伤过程。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595
【图文】：

尼氏体,月龄,路程,参数指标

图 2 高碘对大鼠记忆能力的影响（n = 6）：（A）SPT 中的穿环次数；（B）SPT 中在目标象限所花费的时间与总时间的分比；（C）SPT 中在目标象限的花费的路程与总路程的百分比；（D）SPT 中 4 月龄雌鼠的游泳轨迹。*表示与对照组相比，P<0.05。.4 高碘对大鼠海马组织中尼氏体数量的影响从每组随机选 3 只雌性大鼠使用尼氏染色法研究高碘对大鼠海马组织 CA3域中尼氏体的影响。选择海马组织 CA3 区域中尼氏体的 IOD 值作为参数指标反映海马 CA3 区域中尼氏体的数量。结果表明，与对照组相比，500、2500 5000 μg/L 3 个 KIO3染毒组 4 月龄雌鼠海马组织中尼氏体数量明显减少P<0.05），且随着摄碘浓度的升高，尼氏体数量也呈下降趋势（如图 3A~I）。

尼氏小体,月龄,自噬体,线粒体

图 3 高碘对大鼠海马组织中尼氏小体数量的影响（n=3）（A-D）海马组织 CA3 区域尼氏染色（200 倍）；（E-H）海马组织 CA3 区域染色（400 倍）；（I）尼氏体 IOD 值的定量分析。*与对照组相比，P<0.05。高碘对大鼠海马组织超微结构的影响从每组中随机选择 3 只雌性大鼠通过 TEM 检测大鼠海马组织 CA3 区域中结构的改变。结果表明，与对照组相比，500、2500 和 5000 μg/L 3 个 KIO3组 4 月龄雌鼠呈现出多种异常特征。在 500 μg/LKIO3染毒组 4 月龄雌鼠海织 CA3 区域中，观察到大量细胞凋亡的形态学特征，包括核染色质的均质边缘化，还观察到少量的自噬体（含有线粒体或其他细胞质内容物的双膜）和肿胀的线粒体（如图 4B 和 F）。在 2500 μg/L KIO3染毒组 4 月龄雌鼠海织 CA3 区域中，可观察到许多自噬体、膜消失的线粒体和神经纤维的脱髓变（图 4C 和 G）。在 5000 μg/L KIO3染毒组 4 月龄雌鼠海马组织 CA3 区域观察到了更严重的改变，包括内质网扩张，线粒体肿胀以及线粒体嵴的消图 4D 和 H）。

海马,箭头,月龄,细胞凋亡

图 4 高碘对大鼠海马组织超微结构的影响（n=3）注：黑色粗体箭头表示自噬体；黑色细箭头表明示内质网扩张、肿胀；白色粗体箭头表示线粒体肿胀、嵴消失；白色细箭头表示神经纤维脱髓鞘；井号表示核染色质的均质化；星号表示包括核染色质的均质和边缘化。2.6 高碘对大鼠海马神经元细胞凋亡的影响从每组中随机选择 3 只雌性大鼠使用 TUNEL 试验检测雌性大鼠海马 CA3区域神经元细胞的早期凋亡情况，TUNEL 是通过检测细胞发生凋亡后细胞中出现的 DNA 断裂碎片（染色后呈棕黄色）间接反映细胞凋亡情况。结果显示，对照组 4 月龄雌鼠海马 CA3 区域中 TUNEL 阳性的神经元细胞很少几乎看不到，而 2500 和 5000μg/L KIO3染毒组 4 月龄雌鼠海马 CA3 区域中 TUNEL 阳性的神经元细胞数量较多，明显要多于对照组（如图 5）。

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