JNK1-自噬信号通路在RANKL促进的破骨细胞形成中的作用及机制研究

发布时间：2020-07-13 20:18

【摘要】：骨质疏松症(osteoporosis)是一种全身性的骨代谢性疾病,其发病特点为骨量降低以及骨组织微结构受损,在此基础上骨脆性增高以及骨折的风险明显增加。由破骨细胞主导的骨吸收功能和由成骨细胞主导的骨形成功能间所搭建起来的平衡决定了骨的整体代谢。在骨吸收过程中,破骨细胞的数量和活性发挥着主体作用。RANKL在诱导破骨细胞形成中起关键作用。而RANKL可通过JNK1促进破骨细胞形成。JNK1活化后,通过其下游元件c-Jun磷酸化促进转录因子AP-1形成与活化,导致破骨细胞形成;而且,活化的JNK1可通过独立于c-Jun磷酸化之外的机制调控破骨细胞形成。应激条件下,JNK1可被激活,进一步活化自噬。而自噬参与到破骨细胞的增殖、分化及骨吸收活性中;RANKL对自噬亦有上调作用。但目前破骨细胞形成中,JNK1介导的自噬未得到验证。既往研究表明,在饥饿等应激条件下,JNK1活化后可导致Bcl-2磷酸化,从而使Beclin1从Bcl-2-Beclin1复合体中解离出来,诱导细胞的自噬与生存。而Beclin1在破骨细胞形成中发挥着重要作用。基于RANKL与JNK1之间的通路联系,RANKL有可能通过JNK1促进Bcl-2磷酸化,而导致Beclin1进入自噬流。因此,在RANKL干预下的破骨细胞形成中,JNK1-Bcl-2-Beclin1-自噬信号通路可能为c-Jun磷酸化之外的又一调控机制,这一假设需被验证。因此,本研究的目的在于阐明RANKL-JNK1-Bcl-2-Beclin1-自噬通路在破骨细胞形成中的意义,以期在充实RANKL诱导的破骨细胞自噬机制的同时,为骨质疏松症的治疗提供更多可供参考的药理性靶点。主要研究方法:用RAW264.7细胞系及小鼠原代骨髓源巨噬细胞(BMMs)作为破骨细胞前体(osteoclast precursors,OCPs),结合Western blotting、细胞病毒和siRNA转染、GFP荧光检测、电镜检测、荧光素酶报告基因活性检测、TRAP染色、qRT-PCR、annexin V FITC/PI染色、Tunel染色、免疫共沉淀与免疫荧光共定位等细胞、分子生物学方法等,从体外对破骨细胞形成中RANKL-JNK1信号对自噬活性的调控作用及可能的机制做一探讨。此外,加入IL-17A的研究,将JNK1信号介导的自噬引入到炎症性骨代谢病的研究中去,进一步丰富上述机制探讨。主要研究结果:第一部分JNK1通过自噬-TRAF3信号转导介导RANKL诱导的破骨细胞形成1.在RANKL诱导的破骨细胞形成中,JNK1受抑导致的的OCPs自噬失活可通过自噬蛋白Beclin1得以恢复1)在JNK抑制剂参与下,受到阻滞的OCPs的LC3转换随着Beclin1的过表达得到恢复;2)RANKL使OCPs中的p-JNK1水平上升,而JNK1沉默减弱LC3转换;3)JNK抑制剂介导的LC3 punctation的缩减通过Beclin1过表达而恢复;4)由JNK抑制剂所抑制的自噬溶酶体通过Beclin1的过表达得以恢复。2.Beclin1的过表达可部分缓解JNK1抑制所导致的破骨细胞形成抑制3.TRAF3沉默可逆转JNK抑制剂导致的破骨细胞形成抑制1)Beclin1过表达可在JNK1受抑后,使OCPs中TRAF3的降解水平恢复;2)利用siRNA将TRAF3沉默后,可以缓解JNK1抑制导致的破骨细胞形成的减少。4.在氯喹存在条件下,TRAF3降解不受RANKL的影响1)RANKL与氯喹联合干预下,TRAF3蛋白水平与氯喹单一干预组无异;2)RANKL与氯喹联合干预使得TRAF6和p-JNK1蛋白水平明显上升。5.JNK1受抑可放缓TRAF3的降解并增强氯喹对TRAF3降解的抑制第二部分JNK1介导的自噬在破骨细胞形成过程中通过TRAF3降解发挥抗凋亡作用1.在RANKL诱导的破骨细胞形成中,Beclin1过表达与雷帕霉素均抑制OCPs的凋亡,但氯喹起促进作用1)Beclin1过表达可导致OCPs中caspase-3和PARP切割体明显降低;2)自噬激活剂雷帕霉素使OCPs中caspase-3和PARP切割体、凋亡细胞均明显减少,而自噬抑制剂氯喹的加入则使结果完全相反。2.JNK1受抑后,OCPs自噬活性受抑的同时伴凋亡的反向变化1)JNK1的沉默在防止RANKL诱导的OCPs自噬的同时,还可促进细胞凋亡;2)Beclin1过表达可抑制JNK抑制剂干预下所上调的凋亡水平。3.TRAF3沉默抑制OCPs的凋亡TRAF3沉默后,caspase-3及PARP切割体水平和凋亡细胞数均明显下降。4.TRAF3沉默抑制氯喹所上调的OCPs凋亡TRAF3沉默后,在自噬抑制剂氯喹存在条件下,caspase-3及PARP切割片段和凋亡细胞均显著减少。5.TRAF3沉默防止JNK1抑制后促进的OCPs凋亡TRAF3沉默后,在SP600125存在条件下,caspase-3及PARP切割体水平明显降低,凋亡细胞数显著减少。第三部分JNK1调控的Bcl-2磷酸化介导OCPs的自噬活化1.RANKL介导的p-JNK1、p-Bcl-2与LC3II三者间存在关联用RANKL诱导后,p-JNK1、p-Bcl-2与LC3II三者的水平在时间和浓度依赖上均具有相似的变化趋势,统计学上呈正相关;2.JNK1受抑可逆转由RANKL促进的Bcl-2的磷酸化水平用RANKL干预后,p-Bcl-2水平升高;但JNK1下调后,p-Bcl-2重新下降。3.JNK1的受抑可逆转RANKL抑制的Beclin1与Bcl-2的结合RANKL干预后,Beclin1与Bcl-2的相互结合减弱;但用抑制剂使JNK1受抑或使JNK1基因沉默后,两者的相互结合又得到增强。第四部分IL-17A通过RANKL-JNK1信号通路调控OCPs的自噬1.低浓度IL-17A能增加OCPs的自噬,而高水平IL-17A呈相反结果2.自噬抑制可减少由IL-17A促进的破骨细胞形成3.JNK1信号介导IL-17A促进的OCPs自噬主要结论:1.JNK1信号可通过自噬蛋白Beclin1介导RANKL诱导的OCPs自噬活化与破骨细胞形成;2.JNK1介导的自噬可能通过TRAF3的降解来诱导破骨细胞的形成;3.RANKL介导的TRAF3降解只能依赖于RANKL下游信号激活的自噬;4.在破骨细胞形成中,OCPs自噬活化可伴随凋亡的反向变化;5.TRAF3可介导OCPs凋亡并串联起自噬和凋亡;6.JNK1介导的TRAF3降解可防止OCPs的凋亡;7.RANKL通过Bcl-2磷酸化影响OCPs的自噬活性;8.低浓度IL-17A可能通过RANKL-JNK1通路的激活增强OCPs的自噬反应。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580
【图文】：

过滤膜,阻断剂,分装,载体

E64d（溶酶体阻断剂）试剂的配制：用 DMSO 溶解，配制储存浓0.2μm 过滤膜过滤后分装，存于-20℃，推荐使用浓度为 1ng/ml（1：1 PEPS A（溶酶体阻断剂）试剂的配制：DMSO 溶解 5mg 粉剂（直接配制储存浓度为 1 mg/ml，0.2μm 过滤膜过滤后分装，存于-20℃，推g/ml（1:1000）。病毒真核表达载体 pEX-Beclin1/control-Lv105 的构建与感染目的细eia 公司负责构建和包装）小鼠 Beclin1 基因序列（NC_000077.6）设计引物（见表 2.1），PCR 扩uro-Lv105 载体（图 2.1）使其线性化，并与双链 DNA 连接，随即转化克隆进行 PCR 鉴定及测序。慢病毒的包装：载体系统由目的载体和包sv-REV、pMDIg-pRRE 和 pMD2G）的混合包装载体构成。相同方法X-control-Lv105。将它们转染 293T 细胞，抽提病毒，浓缩，使用 H1度测定，最后感染目的细胞。具体步骤如下：

慢病毒感染,内源性,表达水平,细胞

/ml）的嘌呤霉素，筛选病毒成功感染的阳性细胞，以构建稳定细胞系:以酶解的化受感染的细胞，接种至 6 孔培养板中，添加完全培养基继续孵育 48 小时。随有合适筛选药物的培养基替换旧培养基，每 3 天换液一次，从而筛选出可稳定细胞。3）感染成功的细胞不断增殖而逐渐增加，随着增长到约 90%融合时，胰酶消化代于 6 孔板中，随着细胞增加，再依次传代于 6cm 培养皿及 10 cm 培养皿；当 10cm 后，部分细胞用于实验，部分细胞进行冻存，以备后续实验所用。4）稳定细胞系构建成功后提取细胞总蛋白及 RNA，分别用 Western blotting 及PCR 方法从蛋白水平及 RNA 水平验证慢病毒转导效率（具体方法如下）。Westeting 及定量 PCR 结果提示较感染 LV-control 组细胞，感染 LV-Beclin1 组的细lin1 蛋白及 mRNA（BECN1）水平均显著升高，表明慢病毒表达载体的转导是成图 2.2）。

序列,内源性,转染,表达水平

通过翻译水平的检测，说明 siRNA 的转染是成功的（图2.3）。表 2.1 siRNA 序列siRNA Sequences（5'-3'） Sequences（5'-3'）TRAF3-siRNA GCAGTGAGCCTCACTGTTA Control-siRNA GCAAGCGTCACTCGGTTTAJNK1-siRNA GCACGTAGCTCCATCTAAA Control-siRNA GCAATCGCTACCTTCGAAA图 2.3 通过 Western-Blot 检测的 siRNA(si-TRAF3 或 si-JNK1)转染RAW264.7 细胞后的内源性表达水平2.2.2.5 Western blotting 实验1.以胰蛋白酶消化液收集细胞，用 PBS 缓冲液洗涤 3 次，每次 4℃、2500rpm 离心5 分钟，弃掉上清液，用适量 4℃预冷的细胞裂解液重悬细胞，冰上放置 1 小时，使细胞充分裂解。细胞裂解后，将细胞悬液于 4℃、13000rpm 离心 30 分钟，上清液即为提

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