Cbfa1在氟诱导成纤维细胞成骨中的作用机制探讨

发布时间：2020-07-16 05:18

【摘要】：研究背景:慢性氟中毒是一种地方性疾病,主要病因是摄入过量氟导致以骨骼病变为主的地方性疾病,迄今为止发病机制并不清楚。氟中毒的骨骼改变(氟骨症)包括骨硬化,骨软化,骨质疏松和骨周软组织钙(骨)化,其中骨周软组织钙(骨)化属于异位钙化、异位骨化的范畴,主要见于骨周软组织,其主要细胞成分是成纤维细胞(fibrobalst,FB)。Cbfa1是成骨细胞特异性转录因子,是成骨细胞分化以及成骨的必要条件。本课题组过去的研究中发现,氟化物可以明显增强FB中Cbfa1从mRNA到蛋白的表达,证实FB在氟化物的作用下已经具备了成骨的条件。研究还发现,染氟成纤维细胞中骨代谢调控网络中的其他成骨相关因子的表达也明显增强,提示这些成骨因子亦在FB成骨过程中举足轻重。本研究以体外实验的方法,进一步确认在不同的染氟条件下FB中各种因素的改变,同时寻找各种骨生长因子在染氟FB中的相互关系,试图发现其中是否存在一个或几个重要的始发因素,从而促动或联合其他因子共同刺激FB的成骨过程,以期为氟骨症骨周软组织骨(钙)化的发病机制研究提供科学依据。实验方法:本实验以小鼠成纤维细胞株L929作为研究对象。将FB分为两个染氟剂量组(剂量组一:对照组、0.0001、0.001、0.1、1 mg/L F~-组;剂量组二:对照组、2、5、10 mg/L F~-组)。采用的实验方法包括:CCK-8法检测细胞增殖活性;Gomori钙钴法检测FB碱性磷酸酶活性;实时定量PCR和Western-Blot检测细胞Cbfa1、BMP-2、OCN、TGF-β、IGF-1、FGF-2、PDGF-B、PTH、PTH-rp、CT和CaSR mRNA、蛋白表达水平。同时重点对检测结果进行相关性分析。结果:1.CCK-8结果显示,与对照组相比,2 mg/L F-、5 mg/L F-可刺激细胞活性,10 mg/L F-则抑制细胞活性,且随着染氟时间延长,细胞的增殖活性下降;2.与对照组相比,2 mg/L F-组和5 mg/L F-组ALP活性明显增强,而10 mg/L F-组ALP活性低于对照组;3.实时定量PCR以及Western Blot结果:(1)染氟FB Cbfa1、BMP-2和OCN m RNA和蛋白水平均有提高;(2)染氟FB TGF-βm RNA除染氟10 mg/L组表达增强以外,其余各组变化不明显甚至明显降低,但其蛋白表达水平在各染氟浓度下均明显上调;(3)染氟明显上调FB IGF-1 m RNA和蛋白的表达;(4)染氟0.1 mg/L组和10 mg/L组PDGF-B m RNA表达明显增强,1 mg/L和2 mg/L组PDGF-B蛋白表达明显增强;(5)除染氟0.001 mg/L组外,其余加氟组FGF-2 m RNA表达均增强或明显增强;染氟2 mg/L和5 mg/L组FGF-2蛋白表达明显增强;(6)本实验中PTH m RNA和蛋白在多数染氟组均表达增强,PTH-rp m RNA在较低剂量组表达明显增强,较高剂量组表达明显减弱,而PTH-rp蛋白的表达则与m RNA刚好相反;(7)氟对CT和Ca SR m RNA和蛋白的表达呈普遍增强趋势;4.因素相关分析结果:(1)Cbfa1、BMP-2、OCN、TGF-β(1)染氟1 mg/L组,Cbfa1蛋白和BMP-2蛋白的表达增加呈显著正相关;(2)染氟5 mg/L组,Cbfa1和OCN在FB中的蛋白表达水平呈显著正相关;(3)染氟10 mg/L组Cbfa1和OCN蛋白表达呈正相关关系;(4)BMP-2和OCN之间仅在1 mg/L组蛋白表达存在负相关;(5)TGF-β和Cbfa1、BMP-2、OCN之间关系规律不明显。(2)IGF-1、FGF-2和PDGF-B(1)IGF-1和PDGF-B蛋白表达在染氟5 mg/L、10 mg/L组呈明显正相关;(2)IGF-1、FGF-2 m RNA表达在染氟2 mg/L组明显正相关,但在0.001 mg/L和10 mg/L组呈负相关;(3)FGF-2和PDGF-B m RNA在0.0001 mg/L、0.1 mg/L和5 mg/L组为正相关,蛋白在2 mg/L组正相关,但在0.1 mg/L组负相关;(4)TGF-β和PDGF-B m RNA表达在2 mg/L和5 mg/L组正相关,蛋白在0.001 mg/L组正相关,但在1 mg/L组负相关。(3)PTH、PTH-rp、CT和Cas R (1)PTH和Ca SR m RNA表达在0.1 mg/L和1 mg/L组正相关,0.0001 mg/L和0.001 mg/L组负相关;(2)PTH-rp和Ca SR m RNA在0.001 mg/L、10 mg/L组均为明显正相关,在0.0001 mg/L、0.1 mg/L组为负相关,蛋白在0.0001 mg/L、0.001 mg/L、2 mg/L组为正相关,5 mg/L组为负相关;(3)PTH-rp和CT m RNA表达在0.001 mg/L组负相关,蛋白在10 mg/L组正相关,但在0.001 mg/L、0.1 mg/L组负相关;(4)PTH和PTH-rp蛋白表达在10 mg/L组负相关,m RNA表达在0.0001 mg/L组为正相关,0.001 mg/L和0.1 mg/L组为负相关。结论:1.氟化物明显刺激FB增殖及成骨表型表达(1)氟化物明显刺激FB的增殖、分化;(2)染氟FB中ALP表达明显增强;(3)染氟刺激FB Cbfa1、BMP-2和OCN从m RNA到蛋白的表达。2.染氟FB细胞骨生长因子IGF-1、FGF-2和PDGF-B的表达(1)染氟浓度影响FB中IGF-1 m RNA和蛋白的表达,总的作用以明显上调为主;(2)染氟明显刺激FB中FGF-2和PDGF-B的表达。3.染氟FB PTH、PTH-rp、CT以及Ca SR的表达(1)FB染氟48 h,PTH m RNA和蛋白在多数染氟组以表达增强为主但PTH-rp m RNA在较低剂量组表达明显增强,较高剂量组明显减弱;PTH-rp蛋白则刚好相反;(2)染氟对FB CT的作用以刺激增强为主;(3)染氟FB Ca SR m RNA和蛋白的表达以增强趋势为主。4.Cbfa1与其他相关因素的相关性分析(1)Cbfa1与成骨蛋白、骨生长因子以及和成骨相关的诸多因素存在错综复杂的相互关系。这种相关性受染氟浓度的影响,而且在m RNA和蛋白表达方面反应不同甚至作用相反;(2)成骨相关因素之间存在复杂、规律不明显的相互关系。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R599.1
【图文】：

图 1 FB 生长曲线细胞增长趋势来看，染氟早期，各组细胞的增殖活性均有 5 mg/L 组的细胞增殖活性显著高于对照组，染氟 2 mg/轻微刺激细胞活性。随着染氟时间延长，细胞的增殖活性 氟作用下细胞活性明显受到抑制。同时发现，不同时间段浓度的影响趋势基本相同。i 钙钴法检测 FB 碱性磷酸酶活性

图 1 FB 生长曲线从图中细胞增长趋势来看，染氟早期，各组细胞的增殖活性均有一定程度的提高且染氟 5 mg/L 组的细胞增殖活性显著高于对照组，染氟 2 mg/L 和染氟 10mg/L 只是轻微刺激细胞活性。随着染氟时间延长，细胞的增殖活性下降，并且在 10 mg/L 氟作用下细胞活性明显受到抑制。同时发现，不同时间段细胞增殖受到不同染氟浓度的影响趋势基本相同。3.2 Gomori 钙钴法检测 FB 碱性磷酸酶活性

FBCbfa1mRNA表达

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本文编号：2757574