小檗碱抑制小肠葡萄糖吸收降低糖尿病餐后高血糖及其机制
发布时间：2020-07-19 02:34
【摘要】：研究背景流行病学研究显示,糖尿病餐后高血糖的发生率高达50%,糖尿病前期约70%为单纯性葡萄糖耐量。研究发现餐后高血糖与多种糖尿病慢性并发症密切相关,而控制餐后血糖升高是防治糖尿病的重要策略之一。近年来,作为营养物质吸收的主要器官的小肠在餐后高血糖发生和糖尿病发病过程中的作用逐渐受到重视。研究认为糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强,与餐后血糖升高密切相关。小肠葡萄糖吸收主要由SGLT-1(钠-葡萄糖共转运体1)和GLUT-2(葡萄糖转运体2)介导,其中,GLUT-2介导的葡萄糖转运是餐后小肠吸收葡萄糖的主要方式。进食后,GLUT-2由小肠黏膜上皮细胞胞浆转位至刷状缘,以异化扩散形式将葡萄糖由肠腔转运到血液中。而当罹患糖尿病时,GLUT-2在小肠黏膜上皮细胞刷状缘持续性定位,这可能是糖尿病小肠葡萄糖吸收功能增强及餐后高血糖的原因。因此,纠正糖尿病小肠葡萄糖吸收功能病理性增强成为治疗糖尿病餐后高血糖的重要策略。小檗碱是中药黄连的有效成分,是异喹啉类生物碱。因在治疗腹泻患者时偶然发现低血糖反应而引起糖尿病相关研究者的关注。小檗碱治疗糖尿病的作用机制包括改善糖尿病心血管功能、改善糖脂代谢、改善糖尿病和降低心血管疾病的危险因素等诸多方面。但因小檗碱的生物利用度低,其多项药理学作用机制及临床应用存在争议。尽管有研究表明小檗碱在肠道浓度高,可在肠道局部发挥代谢调节作用,包括抑制二糖酶的功能;促进GLP-1(胰高血糖素样肽1)释放;调节肠道菌群结构等。但小檗碱能否缓解糖尿病小肠葡萄糖吸收能力增强和餐后高血糖的直接证据依然缺乏。针对上述问题,我们课题组在以往研究的基础上,对小檗碱降低糖尿病餐后高血糖的肠道机制做了深入研究。实验目的探讨小檗碱改善糖尿病血糖是否与其在小肠局部影响葡萄糖转运有关,并探讨其作用机制。实验方法采用链脲佐菌素(STZ)联合高脂饮食诱导2型糖尿病小鼠模型。利用随机数表法分组,小檗碱灌胃(200 mg/kg,BW,每日)6周过程中,检测体重、空腹血糖变化情况。通过OGTT、IPGTT(口服葡萄糖耐量、腹腔注射葡萄糖耐量实验)实验检测葡萄糖耐量变化,采用ELISA方法检测血清中GLP-1、GLP-2和胰岛素水平,并检测血清和小肠组织局部IGF-1(胰岛素样生长因子1)、IGFBP-3(胰岛素样生长因子结合蛋白3)水平。离体条件下,采用小肠组织和大鼠小肠黏膜上皮细胞系(IEC-6细胞)进行荧光葡萄糖转运和葡萄糖摄取实验,观察小檗碱对葡萄糖转运和摄取的影响。提取组织、细胞总蛋白和细胞膜蛋白,通过蛋白免疫印迹技术分析小肠葡萄糖转运蛋白的表达和转位情况。进一步,利用免疫荧光、免疫电镜等技术观察小檗碱对GLUT-2蛋白转位的影响。进而,综合利用药物抑制剂和si RNA技术探讨小檗碱对葡萄糖转运蛋白作用进行分子机制的研究。两组间比较采用Dunnett-t检验,多个处理组两两之间比较采用SNK-q检验。实验结果1.与正常对照组相比,STZ联合高脂饮食诱导的2型糖尿病组小鼠体重显著性增加,空腹血糖水平升高,糖耐量异常。经小檗碱(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周治疗后,相较于糖尿病组,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠体重降低、空腹血糖水平下降、葡萄糖耐量得到改善、HOMA-IR降低。2.糖尿病组小鼠小肠葡萄糖转运能力较正常组小鼠增高,糖尿病组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量降低。小檗碱(200 mg/kg/d,BW)灌胃6周后,与糖尿病组相比,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠葡萄糖转运能力降低,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠单位进食量所产生的粪便中葡萄糖含量升高。采用正常动物给予单次灌胃小檗碱(200 mg/kg,BW),观察到单次灌胃小檗碱仅对OGTT实验后的血糖变化具有抑制作用,而对IPGTT实验后血糖变化无降低作用,检测OGTT实验后各时间点的血清胰岛素水平,发现小檗碱单次灌胃组血清胰岛素水平显著性降低,提示小檗碱通过其在小肠局部的直接作用抑制小肠葡萄糖吸收,降低餐后血糖水平。3.离体条件下,利用小肠组织和IEC-6细胞研究小檗碱降低小肠葡萄糖转运。与正常组相比,小檗碱组小肠葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取呈现浓度依赖性降低,GLUT-2抑制剂phloretin(0.5 m M)和si RNA敲低GLUT-2表达均能阻断小檗碱降低小肠组织葡萄糖转运和细胞葡萄糖摄取。结果提示,小檗碱降低小肠葡萄糖转运是通过抑制GLUT-2来实现的。4.在糖尿病模型小鼠中,相较于正常对照组,糖尿病小鼠小肠GLUT-2表达增加,采用提取细胞膜进行蛋白免疫印迹分析、免疫荧光实验和免疫电镜实验等方法均观察到:糖尿病小鼠小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位增多。小檗碱(200mg/kg/d,BW)灌胃6周后,相较于糖尿病组,糖尿病+小檗碱灌胃组小鼠小肠GLUT-2表达降低。同时,GLUT-2向刷状缘转位降低。高浓度葡萄糖(50 m M)处理IEC-6细胞模拟肠腔餐后高浓度葡萄糖的条件下,小檗碱处理可浓度依赖性降低IEC-6细胞GLUT-2转位。以上结果提示,小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2转位至刷状缘。5.与糖尿病组相比,小檗碱灌胃6周组小鼠小肠局部IGF-1、IGFBP-3水平降低,同时,小肠组织中IGF-1R和PLC-β2表达分别降低21.5%,23.1%,提示小檗碱灌胃6周可纠正糖尿病小鼠小肠局部IGF水平异常。6.小檗碱下调IEC-6细胞IGF-1R磷酸化,IGF-1R抑制剂AG1024和si RNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时,小檗碱下调IEC-6细胞PLC-β2胞膜定位,进一步使用PLC-β2抑制剂U73122可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。使用IGF-1R抑制剂AG1024和si RNA敲低IGF-1R表达均可阻断小檗碱降低细胞PLC-β2胞膜定位。提示小檗碱通过抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。7.小檗碱上调IEC-6细胞AMPK磷酸化,AMPK抑制剂Compound C(10μM)可阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2转位。同时,AMPK抑制剂Compound C可阻断小檗碱降低细胞IGF-1R磷酸化。提示小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R,最终降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取。8.小檗碱未上调IEC-6细胞Akt磷酸化水平,PI3K抑制剂Wortmannin(10μM)未阻断小檗碱降低细胞葡萄糖摄取和GLUT-2、PLC-β2胞膜定位,提示小檗碱降低IEC-6细胞GLUT-2转位和葡萄糖摄取可能与PI3K-Akt信号通路无关。结论1.小檗碱降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2向刷状缘转位,从而抑制小肠葡萄糖的吸收,最终降低糖尿病小鼠餐后血糖水平2.小檗碱通过激活AMPK抑制IGF-1R—PLC-β2—GLUT-2信号通路,进而降低小肠黏膜上皮细胞GLUT-2刷状缘转位
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1
【图文】：
介导的葡萄糖吸收无明显作用。肠道内分泌细胞同时表达瘦素受体和甜味受体，随着血清瘦素浓度增高，肠道内分泌细胞的甜味受体对甜味剂的反应性降低，但这一现象与小肠 GLUT-2 转位作用的关系缺乏直接证据[35]。(4)应激和糖皮质激素：多种形式的应激会引起糖皮质激素释放增多，进而引起不同程度的胃肠功能障碍。由环境改变引起的应激状态会抑制 GLUT-2 介导的葡萄糖吸收，但 SGLT-1 介导的葡萄糖吸收不受影响，这种效应可以通过给予动物地塞米松诱导。在禁水应激情况下，SGLT-1 的活性被抑制，这是由于上皮细胞的钠钾-ATP 酶的活性受到抑制，而此时刷状缘 GLUT-2 的定位呈现倍数升高。在禁食应激时，肠腔内糖的吸收主要依靠 SGLT-1完成；复食后，GLUT-2 会迅速向刷状缘转位。由此可见，不同应激环境因素会通过不同机制影响 GLUT-2 的转位，最终影响小肠葡萄糖的吸收[4]。空军军医大学硕士学位论文
图 1. 小檗碱灌胃 6 周降低糖尿病小鼠体重，降低空腹血糖并改善葡萄糖耐量和全身胰岛素敏感性A-B 图：小檗碱灌胃 6 周过程中，各组小鼠体重变化和空腹血糖的变化。C-D 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠葡萄糖耐量的影响。E-F 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠血清胰岛素水平、HOMA-IR 的影响。G 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠血清 GLP-1 的影响。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200 mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200 mg/Kg，BW）组；OGTT，口服葡萄糖耐量测定；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量测定。正常小檗碱灌胃组与正常组相比：*P < 0.05，**P < 0.01，正常组与糖尿病组相比：# P <0.05，## P < 0.01，糖尿病小檗碱灌胃组与糖尿病组相比： P < 0.05， P < 0.01，n=6/组。
细胞葡萄糖摄取。以上实验结果提示，小檗碱降低小肠葡萄糖吸收是通过抑制小肠黏膜上皮细胞 GLUT-2 来实现的。图3 小檗碱剂量依赖性降低小肠葡萄糖转运和IEC-6细胞葡萄糖摄取，抑制GLUT-2可阻断小檗碱降低葡萄糖转运A 图 浓度梯度小檗碱处理对小肠荧光葡萄糖转运的影响。B 图 两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低小肠荧光葡萄糖吸收的影响。C 图 浓度梯度小檗碱处理对 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取的影响。D 图两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取的影响。E 图 siRNA 敲低 GLUT-2 表达。F 图 siRNA 敲低 GLUT-2 表达后，小檗碱对 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取影响的变化情况。HG：高糖（葡萄糖 50 mM）组，Phloridzin：根皮苷（SGLT-1 抑制剂，0.5 mM）组，Phloridzin+BBR 组：根皮苷+小檗碱（50 μM）组，Phloretin：根皮素（GLUT-2空军军医大学硕士学位论文
本文编号：2761770
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1
【图文】：
介导的葡萄糖吸收无明显作用。肠道内分泌细胞同时表达瘦素受体和甜味受体，随着血清瘦素浓度增高，肠道内分泌细胞的甜味受体对甜味剂的反应性降低，但这一现象与小肠 GLUT-2 转位作用的关系缺乏直接证据[35]。(4)应激和糖皮质激素：多种形式的应激会引起糖皮质激素释放增多，进而引起不同程度的胃肠功能障碍。由环境改变引起的应激状态会抑制 GLUT-2 介导的葡萄糖吸收，但 SGLT-1 介导的葡萄糖吸收不受影响，这种效应可以通过给予动物地塞米松诱导。在禁水应激情况下，SGLT-1 的活性被抑制，这是由于上皮细胞的钠钾-ATP 酶的活性受到抑制，而此时刷状缘 GLUT-2 的定位呈现倍数升高。在禁食应激时，肠腔内糖的吸收主要依靠 SGLT-1完成；复食后，GLUT-2 会迅速向刷状缘转位。由此可见，不同应激环境因素会通过不同机制影响 GLUT-2 的转位，最终影响小肠葡萄糖的吸收[4]。空军军医大学硕士学位论文
图 1. 小檗碱灌胃 6 周降低糖尿病小鼠体重，降低空腹血糖并改善葡萄糖耐量和全身胰岛素敏感性A-B 图：小檗碱灌胃 6 周过程中，各组小鼠体重变化和空腹血糖的变化。C-D 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠葡萄糖耐量的影响。E-F 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠血清胰岛素水平、HOMA-IR 的影响。G 图：小檗碱灌胃 6 周对各组小鼠血清 GLP-1 的影响。Control，对照组；Control+BBR，正常灌胃小檗碱（200 mg/Kg，BW）组；DM，糖尿病组；DM+BBR，糖尿病灌胃小檗碱（200 mg/Kg，BW）组；OGTT，口服葡萄糖耐量测定；IPGTT，腹腔注射葡萄糖耐量测定。正常小檗碱灌胃组与正常组相比：*P < 0.05，**P < 0.01，正常组与糖尿病组相比：# P <0.05，## P < 0.01，糖尿病小檗碱灌胃组与糖尿病组相比： P < 0.05， P < 0.01，n=6/组。
细胞葡萄糖摄取。以上实验结果提示，小檗碱降低小肠葡萄糖吸收是通过抑制小肠黏膜上皮细胞 GLUT-2 来实现的。图3 小檗碱剂量依赖性降低小肠葡萄糖转运和IEC-6细胞葡萄糖摄取，抑制GLUT-2可阻断小檗碱降低葡萄糖转运A 图 浓度梯度小檗碱处理对小肠荧光葡萄糖转运的影响。B 图 两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低小肠荧光葡萄糖吸收的影响。C 图 浓度梯度小檗碱处理对 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取的影响。D 图两种葡萄糖转运蛋白抑制剂对小檗碱降低 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取的影响。E 图 siRNA 敲低 GLUT-2 表达。F 图 siRNA 敲低 GLUT-2 表达后，小檗碱对 IEC-6 细胞荧光葡萄糖摄取影响的变化情况。HG：高糖（葡萄糖 50 mM）组，Phloridzin：根皮苷（SGLT-1 抑制剂，0.5 mM）组，Phloridzin+BBR 组：根皮苷+小檗碱（50 μM）组，Phloretin：根皮素（GLUT-2空军军医大学硕士学位论文
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 陈照丽;IGF系统的生物学功能及其与肿瘤的关系[J];国外医学(分子生物学分册);2003年01期
本文编号：2761770
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/nfm/2761770.html
最近更新
教材专著
