WDFY4通过影响B细胞参与系统性红斑狼疮发生发展的作用机制研究

发布时间：2020-07-18 18:19

【摘要】：系统性红斑狼疮(SLE)是一种典型的自身免疫性疾病,患者临床表现主要为体内大量自身抗体的产生及其与自身抗原形成自身免疫复合物沉积所导致的炎症反应和多器官损伤。SLE发病受到多种因素的影响,已有的研究指出遗传因素在SLE的发生中发挥了重要作用,同卵双生患者一致率(24-69%)远远高于异卵双生以及同胞间的患病率(2-5%)。SLE发病机制十分复杂,目前的研究并没有系统性地阐明SLE的发病过程。当前的研究主要从引起SLE发生的几个方面分别介绍其机制,如T细胞、B细胞及细胞因子的影响等。B细胞的过度活化是SLE患者体内最主要的免疫学异常,以自身抗体的产生、异常抗原提呈、产生包括IL-10、IL-6等多种细胞因子与提供异常的B细胞信号为主要表现。许多基因在B细胞的分化发育过程中发挥作用,从而影响SLE的发生。尽管SLE的具体发病机制并不清楚,但大规模的全基因组关联研究(Genome Wide Association Study,GWAS)已经充分证实了遗传因素与SLE的相关性。目前已经发现80多个基因与SLE的发病相关,其中就包括我们所研究的WDFY4基因。WDFY4(WDFY family member 4)基因位于 10q11.23,是WDFY家族的第4位成员。WDFY4基因组序列含有近30万个碱基,可以编码一个含有3184个氨基酸的巨大蛋白。目前已经有多个GWAS指出WDFY4与多个人群的SLE疾病易感相关,且本课题组已明确了WDFY4导致SLE易感的具体位点。但是WDFY4基因导致SLE易感的具体机制尚未有报道不明确。有研究指出WDFY4在免疫系统中高表达,但目前还未见关于该基因功能的研究报道。第一部分Wdfy4条件性敲除小鼠的构建及表型分析目前已知WDFY4与SLE疾病易感相关,且我们前期的研究发现WDFY4在B淋巴细胞中高表达,为了明确WDFY4导致SLE易感的具体机制,我们利用Loxp-Cre系统首次构建了B淋巴细胞条件性敲除Wdfy4的小鼠模型。我们在Wdfy4第三外显子两侧插入Loxp序列,通过基因工程获得Wdfy4flox/+小鼠,并将其与Cd19-Cre转基因小鼠杂交,在仅表达于B细胞的Cd19重组酶的作用下,Wdfy4第三外显子发生重组,Wdfy4基因转录时发生移码突变,翻译提前终止,Wdfy4蛋白功能丧失。最终杂交所得的Wdfy4flox/flox;Cd19-Cre+/-小鼠即为Wdfy4 CKO小鼠,所有小鼠的出生符合孟德尔遗传分离率。我们首先对Wdfy4 CKO及对照小鼠的基本表型进行分析,发现B细胞中敲除Wdfy4后,小鼠外周免疫器官脾脏中CD19阳性细胞数明显少于对照小鼠,说明Wdfy4能够影响B细胞的生存。我们对CKO小鼠及对照小鼠脾脏中各亚型B细胞分别分析,发现CKO小鼠中过渡1型(T1)、成熟B细胞、滤泡B细胞明显减少,而过渡2型(T2)及边缘B细胞没有差异;因此我们认为Wdfy4在B淋巴细胞成熟过程中起重要作用。为了明确Wdfy4对B细胞早期发育的影响,我们对CKO小鼠及对照小鼠中枢免疫器官骨髓中B细胞各发育阶段分别进行了检测。我们发现,与对照相比,CKO小鼠骨髓中总B细胞的数量并没有发生改变,各发育阶段中也只在Pre-B细胞阶段出现了减少,因此我们认为Wdfy4对B细胞的早期发育过程没有影响,而只是在B细胞由Pro到Pre的过渡过程中发挥部分作用。在明确了Wdfy4对B淋巴细胞数量的影响后,我们对B细胞功能进行了研究。由于B淋巴细胞的主要功能是分泌抗体,我们采用向小鼠腹腔注射人工抗原的方式对其进行人工免疫,然后利用ELISA实验检测免疫后小鼠血清中抗体分泌情况。在未进行人工免疫时,Wdfy4 CKO小鼠与对照小鼠血清中基础水平的免疫球蛋白IgG和IgM没有差异。接下来我们分别利用胸腺非依赖性(TI)抗原与胸腺依赖性(TD)抗原对两种小鼠进行免疫,收集免疫后各时间点血清进行ELISA检测。结果显示,在进行TI抗原NP-Ficol1免疫后,Wdfy4 CKO小鼠与对照小鼠相比,血清中IgG及IgM抗体分泌量没有差异。TD抗原NP-CGG免疫后,Wdfy4 CKO小鼠血清中IgM抗体分泌无差异,然而无论是总的NP20-29特异性IgG1抗体还是高亲和力的NP1-4特异性IgG1抗体都发生了明显减少,尤其高亲和力IgG1抗体的比例出现了明显降低。与此相一致的是,经过免疫后,CKO小鼠骨髓及脾脏中B细胞的数量明显减少,同时浆细胞数量和生发中心B细胞也发生减少。因此,我们认为敲除Wdfy4后,B细胞中抗体亲和力成熟受到影响。综合上述结果,我们得出结论,B淋巴细胞中敲除Wdfy4后,小鼠B细胞数量减少,且功能受到抑制。第二部分利用狼疮模型研究Wdfy4在SLE发病中的作用B细胞的过度活化是SLE患者体内最主要的免疫学异常,许多基因在B细胞的分化发育过程中发挥作用,从而影响SLE的发生。从第一部分的研究中我们得出Wdfy4参与了B细胞的发育及分化功能,那么Wdfy4对B细胞的这种作用是否影响了 SLE的发生呢?为了明确Wdfy4在SLE发病中的作用,我们利用化学诱导的方法构建狼疮模型,即分别向Wdfy4 CKO小鼠及对照小鼠注射0.5mL降植烷(Pristane),6个月后对小鼠SLE表型进行检测。注射Pristane6个月后,我们对两种基因型小鼠SLE表型进行分析,处死小鼠,观察并记录小鼠的各项生理指标。脾脏重量及脾重/体重比是衡量小鼠狼疮表型严重程度的重要指标,于是我们首先对两组小鼠的脾重及脾重/体重比进行了检测,结果显示,对照组小鼠脾脏明显肿胀,而Wdfy4 CKO小鼠脾肿大症状明显缓解,脾重/体重比也低于对照。同时对两组小鼠脾脏进行HE染色后发现,对照组小鼠经Pristane诱导后,脾脏红髓与白髓分界不清,结构紊乱,而Wdfy4 CKO小鼠脾脏未出现这种改变。因此,经过狼疮诱导后,Wdfy4 CKO小鼠脾脏表型轻于对照小鼠。此外,由于狼疮小鼠体内产生的大量自身抗体及免疫复合物通常累积在肾脏,从而诱发狼疮样肾炎,于是我们又对两组小鼠肾脏的损伤程度进行了检测。我们收集小鼠24 h尿液,采用考马斯亮蓝法检测两组小鼠蛋白尿含量,结果显示Wdfy4 CKO小鼠尿蛋白水平显著低于对照小鼠。病理组织学分析也显示,对照小鼠的肾脏组织结构紊乱,肾小球增大,肾小球毛细血管基底膜增厚,有明显的炎性细胞浸润,而Wdfy4 CKO小鼠肾小球较为正常。我们又通过免疫荧光实验对肾脏免疫复合物的沉积状况进行了检测,结果证实Wdfy4 CKO小鼠的肾脏中IgG沉积明显少于对照小鼠。因此,经过狼疮诱导后,Wdfy4 CKO小鼠狼疮肾炎表型轻于对照小鼠。利用ELISA实验对小鼠血清中的抗体进行检测也显示两组小鼠总的IgM,IgG及抗DNA双链抗体IgM未有差异,而Wdfy4CKO小鼠自身反应性的抗双链DNA抗体IgG的滴度明显低于对照小鼠。综合上述结果,敲除Wdfy4后小鼠的狼疮病理表现明显减轻,表明该基因在SLE的发生中起着保护作用。第三部分WDFY4参与SLE发生发展的机制研究通过前面的研究我们认为Wdfy4是通过影响B细胞的生存和功能来影响SLE的发生,那么Wdfy4影响B细胞的具体机制是什么呢?由于目前没有关于WDFY4功能的研究,我们从WDFY4的结构入手,发现WDFY4在结构上与同家族的WDFY3极为相似,而WDFY3所编码的ALFY本身是一个自噬相关蛋白。同时目前许多研究已经证实了自噬过程在B细胞的分化发育及功能中起着十分重要的作用,并且已经有研究提出自噬的关键性因子Atg5可能通过调控自噬活动而参与自身性免疫疾病的发生。因此我们作出假设,Wdfy4有可能是通过调控B细胞的自噬活动来影响其生存和功能进而影响SLE疾病的发生发展。为了验证我们的假设,我们利用病毒载体构建了敲低WDFY4的人B淋巴细胞瘤Raji细胞系。发现敲低WDFY4后,Raji细胞中LC3Ⅱ发生明显累积。由于自噬活动本身是一种动态活动,LC3Ⅱ的累积可能是其自噬水平增加而使其产生增多,同时也有可能是由于自噬水平受到抑制导致溶酶体消化减少而引起LC3Ⅱ累积。我们用溶酶体抑制剂氯奎CQ对细胞进行处理,发现LC3Ⅱ的这种累积是进一步增加的,因此我们认为,在敲低WDFY4后,B淋巴细胞的自噬水平是增加的。同时为了验证这一结果我们又利用免疫荧光实验对细胞中LC3焦点的累积情况进行了检测,由于Raji细胞细胞核较大而细胞质较小,我们又构建了敲低WDFY4的HEK293细胞系以观察其胞质中LC3焦点数量,我们发现敲低WDFY4后LC3焦点增加,在加入CQ后焦点进一步增多,由此我们得出敲低WDFY4能够增强自噬活动。另外,值得注意的是,当敲低WDFY4后,经典自噬底物p62并没有减少,而近年来所报道的非经典自噬相关的PI3KC3表达量增加,因此我们认为WDFY4所影响的是非经典的自噬途径。已有研究指出非经典的自噬能够抑制自身炎症减轻狼疮反应,这也与我们第二部分的研究结果相一致。接下来我们又对上述结果进行了体内验证,我们将B细胞条件性敲除Wdfy4小鼠脾脏中B细胞分选出来,Western blot同样显示敲除Wdfy4后,LC3Ⅱ及PI3KC3出现累积。同时免疫荧光观察LC3焦点形成情况,同样地,敲除Wdfy4后LC3聚集现象更为明显。通过以上结果我们得出结论,WDFY4通过抑制非经典自噬途径影响了B细胞的功能。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.241
【图文】：

图１－１小鼠交配策略逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｍｏｕｓｅ邋ｍａｔｉｎｇ邋ｓｔｒａｔｅｇｙ逡逑因型鉴定逡逑试剂配制逡逑ｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ邋（ｐＨ８．３）溶液的配制：逡逑．１邋ｇＴｒｉｓ溶于８００邋ｍｌ三蒸水，加浓盐酸调节ｐＨ值至８．３，待溶液冷却后，逡逑三蒸水定容至１Ｌ。过滤或高压灭菌，４°Ｃ保存。逡逑酶Ｋ缓冲液的配制：逡逑成分逦质量或体积逡逑ＫＣ１逦３＿７３ｇ逡逑

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逦山东大学博士学位论文逦逡逑组织ｍＲＮＡ不能准确评估Ｂ淋巴细胞中肌热＾的敲除效率。我们利用磁珠分选逡逑的方法将小鼠脾脏中的Ｂ淋巴细胞分选出来（图１－５），提取ＲＮＡ后检测效率，逡逑发现在脾脏的Ｂ淋巴细胞中，肌仿ＣＫＯ小鼠奶砂４的表达量明显低于对照，逡逑而在非Ｂ细胞中没有这种差异（图１－６）。至此，我们确定所构建的肌办４Ｂ淋逡逑巴细胞条件性敲除小鼠具有良好的敲除效率。逡逑Ａ逦ＢＭ逦Ｂ逦ＳＰ逡逑

本文编号：2761257