【摘要】：研究背景与目的哮喘是一种典型的2型免疫性疾病,其特征是高水平的免疫球蛋白Ig E和Th2细胞的活化增殖。哮喘主要包括特应性哮喘和非特应性哮喘。特应性哮喘的定义是Ig E介导的肥大细胞脱颗粒,而非特应性哮喘则不存在过敏原特异性Ig E,更多的是固有免疫细胞在发挥作用,如第2组固有淋巴样细胞(ILC2s)、嗜酸性粒细胞(EOS)以及ILC2s分泌的2型细胞因子IL-5和IL-13。非特应性哮喘的发病时间多在1-4月份,与季节性空气传播过敏原关系密切。呼吸系统感染是哮喘最常见的致死原因,且更多见于非特应性哮喘。呼吸道受到蛋白酶过敏原刺激时引起气道上皮屏障的损坏以及组织损伤的应激反应,进一步引起细胞因子IL-33、IL-25和胸腺基质淋巴生成素(TSLP)的释放。当过敏原刺激缺乏T细胞和B细胞的Rag2-/-小鼠时,发现同样可以引起EOS的活化、黏液的分泌以及气道的高反应性等气道炎症性症状。这表明Th2细胞在过敏性炎症的急性期是非必需的。另外,在鼻内注射蛋白酶过敏原时,缺乏IL-33的小鼠肺组织无嗜酸性粒细胞炎症以及黏液的生成,表明了IL-33在蛋白酶过敏原诱导的哮喘中的关键作用。在缺乏ILC的Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中进一步发现EOS的水平以及黏液的分泌都显著下降,证明了ILC2s在过敏性炎症急性期的关键作用。因此,IL-33-ILC2-IL-5/IL-13轴被认为是哮喘早期阶段的重要途径。21世纪初,Tracey等科学家们首次发现了迷走神经介导的胆碱能抗炎通路(CAP),被迷走神经激活的脾神经释放的乙酰胆碱通过与α7型乙酰胆碱受体(α7n ACh Rs)的结合抑制炎症因子的释放。随后,实验研究证实α7n ACh Rs不仅表达在神经元细胞上,在很多免疫细胞上也发现了α7n ACh Rs,并通过基因敲除小鼠验证了α7n ACh Rs在胆碱能抗炎通路中处于核心地位。最近又有实验证实α7n ACh Rs不仅出现在巨噬细胞、T细胞、B细胞上,在ILC2s细胞上也有表达,更重要的是α7n ACh Rs在ILC2s上的表达显著高于其他免疫细胞。基于α7n ACh Rs在胆碱能抗炎通路中的核心地位以及ILC2s高表达α7n ACh Rs,我们拟用α7n ACh Rs激动剂来验证其是否可以通过作用于ILC2s来调节过敏性气道炎症的发生。α7n ACh Rs作为攻克帕金森、重症肌无力、神经性疼痛等疾病的靶点,已经受到越来越多的重视。乙酰胆碱和尼古丁是α7n ACh Rs最常见的激动剂,但他们在与α7n ACh Rs结合的同时还可以与其他受体作用,由此产生了头疼、呕吐和失眠等副作用。因此,乙酰胆碱和尼古丁很难应用于临床的治疗。所以,寻找一种α7n ACh Rs的高度选择性激动剂与α7n ACh Rs结合来治疗气道炎症性疾病是一种新的治疗策略。由阿斯利康公司(Astra Zeneca)研发的螺环类α7n ACh Rs激动剂GTS-21与α7n ACh Rs有较高的亲和力,Lauriane Galle-Treger等研究证实GTS-21对ILC2s介导的气道炎症有显著的抑制作用。相较于GTS-21,由辉瑞公司(Pfizer)研发的PNU-282987与α7n ACh Rs具有更高的亲和力,其作用于α7n ACh Rs的Ki值是27nmol/L,其对于α1、β1、γδ和α3β4几乎没有亲和性,而对于除5-HT3外的单胺类受体、毒蕈碱受体、谷氨酸受体以及GABA受体也均没有激动活性。并且,已有实验室通过小鼠实验证实PNU-282987可以通过改变巨噬细胞的增殖来减轻急性肺损伤。大量的动物实验和临床实验表明α7n ACh Rs可以成为抗炎治疗的一个新的靶点。因此,本课题拟用PNU-282987这种α7n ACh Rs的强效选择性激动剂为ILC2s介导的过敏性气道炎症的治疗开拓新思路和提供理论依据,且进一步探索与GTS-21相比,PNU-282987是否对于ILC2s介导的气道炎症有更强烈的抑制作用。实验方法1体内实验:选用6-8周C57BL/6J雌性小鼠,随机分为PBS对照组、PNU-282987单独用药组、GTS-21单独用药组、IL-33/Alternaria哮喘模型组、IL-33/Alternaria+PNU-282987干预组、IL-33/Alternaria+GTS-21干预组,采用IL-33/Alternaria滴鼻法建立小鼠气道炎症模型,腹腔注射PNU-282987/GTS-21进行干预,HE染色观察肺组织细支气管周围炎性细胞浸润情况,PAS染色观察气道上皮杯状细胞增生及支气管腔内黏液分泌情况。流式细胞术检测各组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS的含量变化。ELISA检测BALF中2型细胞因子IL-5和IL-13蛋白含量的变化。流式胞内染色法分析小鼠肺组织中分泌IL-5和IL-13的ILC2s的含量变化。q RT-PCR检测小鼠肺组织中IL-5、IL-13、IL-33和GATA3基因水平变化。2体外实验:选取6个月以上C57BL/6J雌鼠,首先通过密度梯度离心法分离出单个核细胞,然后利用磁珠分选法分离出单个核细胞中的Lineage-淋巴细胞,再通过流式细胞术从Lineage-淋巴细胞中分选出KLRG-1+Sca-1+细胞。通过这三步得到的细胞即为ILC2s。分选得到的ILC2s均分为PBS组、单独PNU-282987组、单独GTS-21组、IL-33组、IL-33+PNU-282987组、IL-33+GTS-21组进行体外培养。细胞计数检测不同组细胞增殖情况。流式胞内染色法检测ILC2s细胞内Ki67、GATA3、IKK-P和NF-κB p65表达情况。ELISA检测细胞培养上清中IL-5和IL-13蛋白水平的变化。q RT-PCR检测ILC2s细胞中IL-5、IL-13和GATA3的基因水平的变化。实验结果1体内实验结果1.1 PNU-282987抑制了哮喘小鼠肺组织支气管周围炎性细胞的浸润以及支气管腔内黏液的分泌HE染色和PAS染色结果:与PBS组相比,IL-33/Alternaria模型组小鼠细支气管周围有大量胞浆被染成鲜红色的炎性细胞浸润,且支气管气道上皮处由于有大量细胞增生,支气管的厚度明显增加,同时支气管腔内有大量被染成红色的黏液;与IL-33/Alternaria模型组相比,IL-33/Alternaria+PNU-282987干预组和IL-33/Alternaria+GTS-21干预组小鼠肺组织中细支气管周围炎性细胞的浸润数量明显减少,支气管黏膜处细胞的增生及黏液的分泌明显减少。1.2 PNU-282987抑制了哮喘小鼠BALF和肺组织中EOS的募集以及ILC2s的增殖PNU-282987/GTS-21单独用药组与PBS对照组相比,小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS的含量均无明显差异(p0.05);与PBS/PNU-282987/GTS-21对照组相比,Alternaria模型组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS的百分比和绝对值含量均明显升高(p0.05);与Alternaria模型组相比,Alternaria+PNU-282987/GTS-21干预组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS的百分比和绝对值含量均降低(p0.05);与Alternaria+GTS-21组相比,Alternaria+PNU-282987干预组小鼠肺组织及BALF中ILC2s和EOS百分比和绝对值含量均无明显差异(p0.05)。1.3 PNU-282987抑制了哮喘小鼠肺组织中ILC2s的功能活化PNU-282987/GTS-21单独用药组与PBS对照组相比,小鼠BALF中的IL-5、IL-13的蛋白含量均无统计学差异(p0.05);与PBS/PNU-282987/GTS-21对照组相比,Alternaria模型组小鼠BALF中的IL-5和IL-13的蛋白含量均显著升高(p0.05);与Alternaria模型组相比,Alternaria+PNU-282987/GTS-21干预组小鼠BALF中IL-5和IL-13含量均明显下降(p0.05);Alternaria+PNU-282987干预组和Alternaria+GTS-21干预组相比,两组BALF中IL-5的蛋白水平无明显差异,但Alternaria+GTS-21组BALF中IL-13的蛋白水平更低(p0.05)。1.4 PNU-282987抑制了哮喘小鼠肺组织中IL-5、IL-13、GATA3、IL-33基因表达PNU-282987/GTS-21单独用药组与PBS对照组相比,小鼠肺组织中IL-5、IL-13、IL-33和GATA3 m RNA的相对表达量无统计学差异(p0.05);与PBS对照组相比,Alternaria模型组小鼠肺组织中IL-5、IL-13、IL-33和GATA3基因的相对表达量明显增加(p0.05);与Alternaria模型组相比,Alternaria+PNU-282987/GTS-21干预组小鼠肺组织中IL-5、IL-13、IL-33和GATA3m RNA的相对表达量显著减少(p0.05)。1.5 PNU-282987抑制了哮喘小鼠肺组织中IL-5+ILC2s和IL-13+ILC2s的含量与Alternaria模型组相比,Alternaria+PNU-282987/GTS-21干预组小鼠肺组织中IL-5+ILC2、IL-13+ILC2的百分比明显降低(p0.05);Alternaria+PNU-282987组和Alternaria+GTS-21组相比,分泌IL-5和IL-13的ILC2s的含量无明显差异(p0.05)。2体外实验结果2.1 PNU-282987在体外抑制了ILC2s的增殖培养72h之后,对各组细胞分别进行计数,IL-33刺激组细胞数较PBS组、PNU-282987组和GTS-21组有明显增多(p0.05);IL-33+PNU-282987/GTS-21组较IL-33组细胞数量明显减少(p0.05);IL-33+PNU-282987和IL-33+GTS-21两组之间细胞减少程度无统计学差异(p0.05)。2.2 PNU-282987抑制了ILC2s细胞培养上清中IL-5和IL-13的表达ELISA检测72h细胞培养上清中IL-5和IL-13的蛋白含量。实验结果发现IL-33组细胞培养上清中IL-5和IL-13的蛋白水平较PBS组、PNU-282987组和GTS-21组明显升高(p0.05),IL-33+PNU-282987/GTS-21组IL-5和IL-13的蛋白水平明显下降(p0.05),且两组之间对IL-5和IL-13的抑制作用无明显差异(p0.05)。2.3 PNU-282987抑制了ILC2s细胞中IL-5和IL-13的m RNA水平培养72h后,提取各组细胞RNA,q RT-PCR检测发现IL-33组IL-5和IL-13的m RNA水平与PBS组、PNU-282987组和GTS-21组相比均有明显升高(p0.05);IL-33+PNU-282987/GTS-21干预组与IL-33刺激组相比,IL-5和IL-13的m RNA水平均明显降低(p0.05),且PNU-282987和GTS-21对于IL-5 m RNA和IL-13 m RNA的抑制作用无统计学差异(p0.05)。2.4 PNU-282987抑制了ILC2s细胞内Ki67、GATA3、P-IKK和NF-κB p65的表达培养24h之后,收集各组细胞进行流式胞内染色,检测核内磷酸化蛋白IKK-P和NF-κB p65的表达水平,检测发现相较于PBS组、PNU-282987组和GTS-21组,IL-33组IKK-P平均免疫强度(Mean fluorescence intensity,MFI)和NF-κB p65 MFI水平均明显升高(p0.05);而与IL-33刺激组相比,IL-33+PNU-282987/GTS-21组IKK-P MFI水平和NF-κB p65 MFI水平均有明显降低(p0.05),但相较于GTS-21,PNU-282987对IKK-P和NF-κB p65的抑制作用更强(p0.05)。培养72h之后,胞内染色检测转录因子GATA3和增殖因子Ki67的蛋白表达量,检测发现IL-33组相较于PBS组、PNU-282987组和GTS-21组,GATA3的表达量明显升高(p0.05);IL-33+PNU-282987/GTS-21组相较于IL-33组,GATA3的蛋白表达量均明显降低(p0.05),但PNU-282987和GTS-21对于GATA3的抑制作用无统计学差异(p0.05)。IL-33组Ki67+ILC2s百分比较PBS组、PNU-282987组和GTS-21组相比均有明显升高(p0.05);IL-33+PNU-282987/GTS-21组相较于IL-33组相比,Ki67的表达量均明显下降(p0.05),但GTS-21对Ki67的抑制作用更加明显(p0.05)。结论PNU-282987通过与ILC2s表面的α7n ACh Rs结合减弱了关键性转录因子GATA3和炎症调节因子IKK和NF-κB的磷酸化,进而抑制了ILC2s的功能效应和ILC2s介导的气道炎症。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R562.25
【图文】：
图 3.1 IL-33 模型小鼠肺组织病理学染色结果（200×、n=6）3.2 PNU-282987 抑制了 Alternaria 哮喘小鼠肺组织支气管周围炎性细胞的浸润以及支气管腔内黏液的分泌H&E 和 PAS 染色结果显示：PBS 组、PNU-282987 组和 GTS-21 组细支气管周围未见炎性细胞浸润，肺泡组织呈正常的规则形态，气道上皮杯状细胞无增生，支气管腔内未见黏液分泌；Alternaria 模型组小鼠细支气管周围有大量炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，气道上皮杯状细胞明显增加，管腔内有大量被染成紫红色的黏液分泌；相较于 Alternaria 模型组，Alternaria+PNU-282987/GTS-21 干预组小鼠细支气管周围浸润的炎性细胞明显减少，肺泡组织结构有所改善，气道上皮杯状细胞增生明显减弱，黏液分泌明显减少；Alternaria+PNU-282987 组和Alternaria+GTS-21 组相比，肺组织的炎症情况无明显差异（见图 3.2）。
图 3.2 Alternaria 模型小鼠肺组织病理学染色结果（200×、n=6）为了更加准确的对肺组织炎症情况进行评估，我们对 H&E 染色和 PAS 染色结果进行评分，评分标准如下：表 3.1 H&E 染色组织病理学评分标准分值 得分标准气道炎症 0 气管周围无炎性细胞1 一些气管周围有少量炎性细胞2 一些气管周围有显著炎性细胞3 大多数气管周围有一些炎性细胞4 大多数气管周围有显著炎性细胞血管炎症 0 血管周围无炎性细胞1 一些血管周围有少量炎性细胞2 一些血管周围有显著炎性细胞3 大多数血管周围有一些炎性细胞4 大多数血管周围有显著炎性细胞肺实质炎症 0 㩳1%肺野
结 果表 3.2 PAS 染色组织病理学评分标准得分 得分标准PAS+细胞/气道上皮细胞 0 㩳5%1 5-25%2 25-50%3 50-75%4 㧐75%注：计数评分时，每个样本需计数 10-20 个气管，最后得分取平均值。从 H&E 和 PAS 评分结果来看，Alternaria+PNU-282987/GTS-21 干预组与Alternaria 模型组相比得分明显降低（p㩳0.05）；Alternaria+PNU-282987 与Alternaria+GTS-21 组相比，两者得分无明显差异（p㧐0.05）（见图 3.3）。
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