中性粒细胞胞外网状陷阱在类风湿关节炎致病机制中的初步探究

发布时间：2020-07-20 17:06

【摘要】：目的:探究中性粒细胞胞外网状陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)对类风湿关节炎患者主要的效应细胞滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA-FLSs)和滑膜巨噬细胞的作用机制。方法:取RA患者滑膜组织分离培养滑膜成纤维细胞,进行免疫荧光染色鉴定;通过小鼠腹腔刺激实验获取并培养巨噬细胞;提取健康人外周血中性粒细胞,刺激NETs形成并提取NETs;用Cell Titer 96?AQueous单溶液试剂(MTS)增殖实验评估NETs对RA-FLSs增殖;NETs刺激RA-FLSs60h后,分别收集细胞上清液和细胞,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6(interlukin-6,IL-6)和白细胞介素25(interlukin-25,IL-25)的水平;收集的RA-FLSs提取总RNA,用定量逆转录聚合酶链式反应(q RT-PCR)测定RA-FLSs中结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)m RNA的表达情况,收集RA-FLSs提取总蛋白,用蛋白质免疫印迹实验(western blot,WB)检测哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)表达变化;将NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液加入巨噬细胞培养7d,瑞吉染色观察细胞形态变化。采用配对样本t检验和单因素方差分析对结果进行统计学处理。结果:1)分离纯化的中性粒细胞体外刺激可形成NETs,提取的NETs测定DNA浓度为58.5ng/ul(1×106细胞);2)与对照组(0ul NETs)相比,NETs能促进RA-FLSs增殖,且随着NETs浓度增加其促进RA-FLSs增殖的能力也增强(F=99.519,P0.001);3)与对照组(0ul NETs)相比,10ul NETs可以明显促进RA-FLSs增殖(t=-12.226,P0.01);4)用DNaseⅠ预处理NETs后,其促进RA-FLSs增殖的作用受到抑制(t=-2.376,P=0.049);5)NETs能刺激RA-FLSs内CTGF m RNA表达上调(30.696±0.468,t=12.13,P0.01);6)与对照组相比,NETs能刺激RA-FLSs内MST1激酶表达显著下调(P0.01);7)NETs刺激RA-FLSs60h后细胞上清液中IL-6和IL-25浓度高于对照组(P0.05);8)NETs刺激RA-FLSs60h后收集的上清液加入巨噬细胞培养7d后,巨噬细胞有一部分分化成了多核巨细胞,而用RA-FLSs上清液培养滑膜巨噬细胞7d后未发现有多核巨细胞生成。结论:NETs在体外能促进RA-FLSs增殖并刺激RA-FLSs内MST1激酶表达显著下调,CTGF m RNA表达上调,细胞上清液中IL-6、IL-25浓度高于对照组,提示NETs可能通过调控MST1激酶介导RA-FLSs增殖、产生CTGF及释放多种炎性细胞因子。NETs刺激RA-FLS60h后收集的上清液能诱导巨噬细胞分化成多核巨细胞。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22
【图文】：

荧光染色,中性粒细胞,细胞外,箭头

图1：荧光染色鉴定NETs形成激中性粒细胞形成NETs，PicoGreen荧光染色可见细胞外纤维网状Ts浓度测定粒细胞分离纯化后体外刺激形成NETs，提取的NETs测定D（1 106细胞）。-FLSs鉴定疫荧光技术鉴定，绿色显示是滑膜成纤维细胞的胞浆部分，维细胞的细胞核。细胞纯度＞99%。

免疫荧光,滑膜成纤维细胞,荧光染色

图1：荧光染色鉴定NETs形成PMA刺激中性粒细胞形成NETs，PicoGreen荧光染色可见细胞外纤维网状结构，箭头标识为NETs3.1.2 NETs浓度测定中性粒细胞分离纯化后体外刺激形成NETs，提取的NETs测定DNA浓度58.5ng/ul（1 106细胞）。3.1.3 RA-FLSs鉴定经免疫荧光技术鉴定，绿色显示是滑膜成纤维细胞的胞浆部分，蓝色圆点是滑膜成纤维细胞的细胞核。细胞纯度＞99%。

上清液,巨噬细胞,对照组,巨细胞

图3：NETs刺激RA-FLSs增殖A：与对照组（0ul NETs）相比，NETs能促进RA-FLSs增殖，且随着NETs浓A-FLSs增殖的能力也增强（F=99.519,P<0.01）；图3B：与对照组（0ul NETs）Ts可以明显促进RA-FLSs增殖（t=-12.226，P<0.01）；用DNaseⅠ预处理NET-FLSs增殖的作用受到抑制（t=-2.376，P=0.049）。NETs刺激RA-FLSs的上清液培养巨噬细胞NETs刺激RA-FLSs60h后的上清液去培养滑膜巨噬细胞7d，实验组巨部分分化成了多核巨细胞，很可能就是分化成了破骨细胞，而对照组巨细胞。

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