人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道Muc5ac表达的影响

发布时间：2020-07-23 16:50

【摘要】：第一部分人羊膜间充质干细胞分离、培养及鉴定目的:分离、培养来自胎盘羊膜组织的人羊膜间充质干细胞(h AMSCs),在流式细胞检测技术下进行免疫筛选鉴定人羊膜间充质干细胞,为进一步动物实验准备良好的干细胞移植材料。方法:无菌技术支持下获取遵义医学院附属医院健康足月产妇新鲜娩出的胎盘,通过羊膜组织的双酶(胰蛋白酶+I型胶原酶)消化分离获得单个细胞,在混入10%胎牛血清的低糖培养基中贴壁筛选、纯化、体外传代,镜下分别每日观察三代细胞增殖状态及形态变化。使用流式细胞表面分选仪对P3代的人羊膜间充质干细胞进行表面标志CD90,CD105,CD44,CD73鉴定。结果:人羊膜间充质干细胞呈单纯贴壁生长,呈纤维条状,细长梭形。细胞流式显示:第三代人羊膜间充质干细胞高表达CD90,CD105,CD44,CD73,低表达或不表达CD34,CD11b,CD19,CD45和HLA-DR。结论:体外条件下成功分离出人羊膜间充质干细胞,并可体外短期稳定增殖和长期传代培养。第二部分人羊膜间充质干细胞静脉移植对哮喘小鼠气道Muc5ac表达的影响目的:探讨人羊膜间充质干细胞(h AMSCs)静脉移植对哮喘小鼠气道Muc5ac表达的影响。方法:将40只6-8W雌性BALB/c小鼠按随机数字标记法分为正常组(NS组)、哮喘组(AS组)、人羊膜间充质干细胞干预组(AS+h AMSCs)、人羊膜间充质干细胞自身对照组(NS+h AMSCs)、地塞米松干预组(AS+DEX),每组8只。AS组于第1、13天予OVA溶液腹腔、颈部皮下注射致敏,第19d在自制的雾化笼内雾化吸入10%OVA溶液连续激发5d,末次激发24h后取材。NS组用生理盐水代替OVA溶液,余同AS组;AS+h AMSCs组在第1次致敏后第18d通过尾静脉注射Brdu标记的P3人羊膜间充质干细胞悬液(1×106)0.25ml/只,余处理同AS组;NS+h AMSCs组第18d经尾静脉注射Brdu标记的P3人羊膜间充质干细胞悬液(1×106)0.25ml/只,余处理同NS组;AS+DEX组于每日雾化激发前30min,予地塞米松2mg/kg腹腔皮下注射,余处理同AS组;观察各组小鼠BALF细胞总数和瑞氏-吉姆萨细胞分类计数,ELISA检测IL-5、IL-12、IL-17程度变化,免疫荧光技术观察人羊膜间充质干细胞经Brdu标记阳性率及人羊膜间充质干细胞在体内定植情况;HE染色观察比较各组肺组织病理学变化,AB-PAS染色观察气道上皮组织杯状细胞及黏液物质变化情况,蛋白质印迹技术检测肺组织Muc5ac蛋白表达水平。结果:免疫抗体荧光技术在AS+h AMSCs组和NS+h AMSCs组均可追踪到人羊膜间充质干细胞在小鼠肺内定植,其中AS+h AMSCs组追踪到人羊膜间充质干细胞在肺组织内定植较NS+h AMSCs组明显。AS+h AMSCs组BALF细胞总计数、嗜酸性粒细胞占比、IL-5、IL-17表达水平、气道周围炎症浸润程度评分、气道上皮组织杯状细胞数量和黏液物质表达阳性相对着色面积(IOD值)、肺组织Muc5ac蛋白表达水平均较AS组降低(P0.01);较NS组增高(P0.01)。IL-12表达水平较AS组升高,但较NS组低(P0.01)。NS+h AMSCs组与NS组比较,各项指标差异均无差异(P0.05)。结论:1.外源性人羊膜间充质干细胞静脉移植可定向归巢至小鼠肺内,且以哮喘小鼠较为明显。2.人羊膜间充质干细胞干预哮喘小鼠可通过降低气道炎症及气道Muc5ac的表达水平,其机制可能是人羊膜间充质干细胞发挥免疫调节作用减轻气道炎症细胞的浸润,抑制IL-5、IL-17的表达水平及促进IL-12表达,进而抑制各炎症因子的表达,导致气道Muc5ac的表达下降。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25
【图文】：

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遵义医学院硕士学位论文翁敏华1.3.1 人羊膜间充质干细胞的分离培养1）产妇及胎儿术前各项检查均无异常并签署获取废弃胎盘羊膜组织的知情同意书，采集足月孕产妇新鲜娩出的胎盘，参照 Magatti 及陈勇等的方法[36-37]分离出人羊膜间充质干细胞；2）穿戴无菌手套，铺无菌单，先用加入了 P/S 双抗的 D-Hank’s 液充分洗净胎盘的胎儿面，联合使用无菌手术刀和镊子剥离羊膜，边剥离边用剩余的 D-Hank’s 液继续冲洗。将完全剥离出来的胎儿面羊膜浸入 D-Hank’s 液并低温转运，迅速带入实验室；见图 1、图 2。

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遵义医学院硕士学位论文翁敏华传代培养可获得较纯的干细胞。传代后的间充质干细胞生长迅速，2 小时左右开始贴壁，3-4 天即可铺满瓶底，其形态呈单层放射状或螺旋状紧密排列，与原代细胞接近。传至 P3，细胞及核占比增加，形态结构仍呈旋涡状、长梭形紧密排列。见图 3、图 4。

【参考文献】