糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞脂向分化能力及EGb761干预效应

发布时间：2020-07-23 21:54

【摘要】：第一部分 糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞脂向分化能力目的：体外诱导db/db鼠和db/m鼠的BMSCs向成脂细胞分化,比较其脂向分化能力有无差异。方法:取8w龄db/db鼠和db/m鼠的BMSCs,通过流式细胞仪分别检测其细胞表面标记物,CCK-8法检测比较两种小鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的差异,成脂诱导21d后行油红O染色;应用RT-PCR检测PPARγ、C/EBPα的基因表达；通过WesternBlot检测成脂细胞相关因子PPARγ、C/EBPα蛋白表达量。结果：1.两种小鼠的BMSCs均高度表达CD29、CD44,而低表达CD34、CD45(db/m鼠BMSCs阳性率分别为99.5%、99.1%、2.7%和2.8%,db/db鼠BMSCs阳性率分别为94.6%、97.4%、3.1%和4.1%)；2.db/db鼠BMSCs增殖能力稍低于对照组db/m鼠(P0.05)；3.油红O染色示db/db组骨脂肪滴数量明显多于db/m组,且脂肪滴的体积亦大于db/m组；4.RT-PCR检测显示成脂诱导21d,db/db组PPARγ和C/EBPa基因表达量均明显高于db/m组(P0.05)；5.Western Blot检测显示成脂诱导21d,db/db组PPARγ和C/EBPα蛋白表达量均明显高于db/m组(P0.05)结论：1.db/db鼠和db/m鼠的p3 BMSCs的活力强、纯度高,增殖能力无明显差异；2.db/db鼠BMSCs脂向分化能力明显强于db/m鼠。第二部分EGb761对糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响目的：db/db鼠BMSCs成骨诱导分化的过程中加入EGb761进行干预,观察其对BMSCs骨向分化能力的影响。方法：取8w龄db/db鼠的BMSCs,CCK-8法筛选EGb761对db/db鼠BMSCs的细胞毒性,选取最佳浓度干预db/db鼠BMSCs成骨分化,第]4d行茜素红染色,测定ALP活性,RT-PCI检测ALP、RUNX2基因的表达,Western Blot检测ALP、RUNX2蛋白水平的表达。结果：1.浓度在1000 mg/L以下的EGb761对细胞的生长增值无明显细胞毒作用,选取最佳刺激浓度10mmg/L；2.茜素红染色示：EGb761干预组与诱导组相比矿化结节较大,数量较多,染色较深,呈现为红褐色：EGb761干预组ALP活性强于诱导组(P0.05)；3.与正常成骨诱导组相比,EGb761干预组ALP和RUNX 2基因表达量均明显增强(P0.05)；4.与正常成骨诱导组相比,EGb761干预组ALP和RUNX 2蛋白表达水平均明显上升(P0.05)。结论：EGb761可促进db/db小鼠BMSCs向成骨细胞分化。第三部分EGb761对糖尿病小鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力的影响目的：db/db鼠BMSCs成脂分化的过程中加入EGb761进行干预,观察BMSCs脂向分化能力是否减弱,初探EGb761对BMSCs脂向分化的影响及可能机制。方法：取8w龄db/db鼠BMSCs,成脂分化过程中予EGb761进行干预,21d后行油红O染色,RT-PCI检测PPARγ、C/EBPα和β-catenin的基因表达,Western Blc检测PPARγ、C/EBPα和β-catenin的蛋白表达。结果：1.油红O染色示EGb761干预组脂肪滴数量明显少于正常诱导组,且脂肪滴的体积亦小于正常诱导组；2.RT-PC检测显示成脂诱导21d,EGb761干预组PPARγ和C/EBPa基因表达量均明显低于正常诱导组(P0.05),而β-catenin的基因表达量明显高于正常诱导组(P0.05)；3Western Blot检测显示EGb761干预组PPARγ和C/EBPα蛋白表达量均明显低于正常诱导组(P0.05),而β-catenin的蛋白表达量明显高于正常诱导组(P0.05)。结论：EGb761可抑制db/db鼠BMSCs向脂肪细胞分化,可能机制之一是EGb761可调节BMSCs成脂分化过程中Wnt通路部分相关基因的表达水平。
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1

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本文编号：2767891