牛磺酸通过PPARγ-mTORC2通路调控自噬缓解砷所致胰岛素抵抗的实验研究

发布时间：2020-07-26 22:57

【摘要】：目的:我们发现无机砷可抑制过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(PPARγ),激活细胞自噬过程,同时牛磺酸可显著激活PPARγ并抑制自噬过程,但牛磺酸缓解胰岛素抵抗的作用机制和靶标尚不清楚。因此,本研究拟探索牛磺酸对砷所致胰岛素抵抗进行营养干预的可行性及可能机制。方法:体内实验中,以C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,通过自由饮水的方式暴露于浓度为1~4 mg/L的三氧化二砷(As2O3),牛磺酸保护组在自由饮用浓度为4 mg/L的As2O3基础之上,每天用250 mg/kg牛磺酸灌胃,为期12周。12周后,行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)检测小鼠葡萄糖耐受能力;测量小鼠肝脏重量;制作肝脏石蜡切片,用糖原染色法(PAS染色)检测肝组织中糖原合成情况,用免疫荧光技术检测肝组织中磷酸化蛋白激酶C(p-Akt)蛋白的表达;用实时定量PCR(RT-PCR)检测肝组织中糖异生基因葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6pase)、果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase)、叉头框蛋白(Forkhead box protein O1,FOXO1)、磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)以及糖酵解基因L-型丙酮酸激酶(L-pyruvate kinase,L-PK)和葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)的表达;用免疫蛋白印记法(Western blot)检测糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、磷酸化GSK3β(p-GSK3β)、糖转运蛋白2(GLUT2)以及通路相关蛋白Akt、p-Akt、PPARγ的表达情况。体外实验中,以人HepG2细胞为研究对象。用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测不同浓度亚砷酸钠(Na As O_2)处理后的HepG2细胞存活率的变化;1~4μM Na As O_2作用HepG2细胞24 h,用Western blot检测HepG2细胞中通路相关蛋白PPARγ、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2(mTORC2)、Akt、p-Akt、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、P62/SQSTM1蛋白的表达水平;预先使用PPARγ激活剂罗格列酮(RGS)、mTORC2激活剂棕榈酸盐(PA)、自噬小体形成抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和牛磺酸处理后,用4μM浓度的Na As O_2作用HepG2细胞24 h。用Western blot检测HepG2细胞中通路相关蛋白PPARγ、mTORC2、Akt、p-Akt、LC3-Ⅱ、P62以及糖代谢相关蛋白GSK3β、p-GSK3β、GLUT2的表达情况;用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测HepG2细胞中葡萄糖摄取量。结果:暴露于浓度为1~4 mg/L的As2O3后,小鼠肝脏重量显著减轻,而牛磺酸保护组小鼠肝脏重量与高浓度染毒组(单纯暴露于As2O3,浓度为4 mg/L)相比显著增高;OGTT结果显示,在0、15、30、120 min时,高浓度染毒组小鼠血糖明显高于对照组且具有统计学差异,牛磺酸干预后血糖水平下降且具有统计学差异。葡萄糖口服耐量测试血糖曲线下面积(OGTT-AUC)结果显示As2O3暴露可引起葡萄糖耐量异常,牛磺酸干预后可缓解As2O3引起的葡萄糖耐量异常;PAS染色结果显示,肝组织糖原含量随着As2O3染毒浓度的增加而显著减少,而牛磺酸保护组中肝组织糖原含量与高浓度染毒组相比显著增加;RT-PCR结果显示肝组织糖异生基因表达随As2O3染毒浓度的增加而增加,糖酵解基因表达随As2O3染毒浓度的增加而减少。同上,牛磺酸保护组保护作用明显,与高浓度染毒组相比,牛磺酸保护组中糖异生基因表达减少而糖酵解基因表达有所增加;Western blot结果显示随着As2O3染毒浓度的增加,肝组织中PPARγ、p-Akt和GLUT2蛋白表达显著减少,p-GSK3β蛋白表达显著增加,免疫荧光结果进一步验证肝组织p-Akt表达随As2O3染毒浓度的增加而减少,与高浓度染毒组相比,牛磺酸保护组的保护作用显著,差别有统计学意义。在体外实验中,用不同浓度NaAsO_2作用HepG2细胞24 h,细胞存活率随Na As O_2染毒浓度的增加而降低;1~4μM Na As O_2作用HepG2细胞24 h,Western blot结果显示,与对照组相比,PPARγ、mTORC2、p-Akt和LC3-Ⅱ蛋白表达降低,P62蛋白表达增加。加入RGS和牛磺酸预处理后,PPARγ蛋白表达与染毒组(单纯暴露于Na As O_2,浓度为4μM)相比有显著增加。加入RGS、PA和牛磺酸预处理后,mTORC2和p-Akt蛋白表达与染毒组相比有显著增加。加入RGS、PA、3-MA和牛磺酸预处理后,LC3-Ⅱ和p-GSK3β蛋白表达与染毒组相比有显著降低,P62和GLUT2表达与之相反;葡萄糖氧化酶-过氧化物酶测定结果显示,在HepG2细胞中,与对照组相比,染毒组培基中的葡萄糖含量增加。加入RGS、PA、3-MA和牛磺酸干预后,与染毒组相比,培基中的葡萄糖含量有所减少,提示细胞摄取葡萄糖能力增加。结论:牛磺酸通过PPARγ-mTORC2通路调控自噬缓解砷所致胰岛素抵抗。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1;R595
【图文】：

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19图 1As2O3对小鼠肝脏糖代谢的影响以及牛磺酸的保护作用1~4 mg/kg As2O3处理 C57BL/6J 小鼠 12 周，牛磺酸保护组小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基础上每天用 250mg/kg 牛磺酸进行灌胃。（A）小鼠肝脏重量。（B-C）小鼠 OGTT 以及小鼠 OGTT-AUC。n=7，条图以均值±标准差来表示，* 表示与对照组相比较，P<0.05，** 表示与对照组相比较，P<0.01，#表示与高浓度染毒组相比较，P<0.05，##表示与高浓度染毒组相比较，P<0.01。（D）PAS 染色测定小鼠肝脏糖原含量。1.2 As2O3对小鼠肝脏糖代谢基因水平的影响以及牛磺酸的保护作用我们对小鼠肝脏组织中糖酵解基因和糖异生基因进行了检测。RT-PCR 结果显示，与正常组小鼠相比，高浓度染毒组小鼠肝脏糖酵解基因： L-PK 和 GK 的表达水平显著降低。给予牛磺酸预处理后，与高浓度染毒组相比，各基因表达水平均

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20图 2As2O3对小鼠肝脏糖代谢基因水平的影响以及牛磺酸的保护作用 mg/kg As2O3处理C57BL/6J小鼠12周，牛磺酸保护组小鼠在4 mg/kg As2O3染毒基础上每天用25进行灌胃。（A）RT-PCR 检测糖酵解基因 GK 和 L-PK 表达水平。（B）RT-PCR 检测糖异生基因 G6e、FOXO1、PEPCK 和 PGC-1 表达水平。n=3，条图以均值±标准差来表示，* 表示与对照组相，** 表示与对照组相比较，P<0.01，##表示与高浓度染毒组相比较，P<0.01。 As2O3对小鼠肝脏糖代谢蛋白水平的影响以及牛磺酸用Western blot 结果显示，GLUT2 蛋白的表达随 As2O3染毒剂量的增加而T2 是肝脏进行葡萄糖转运的重要载体，其表达下降提示 As2O3暴露降低萄糖转运能力。p-GSK3β 随 As2O3染毒剂量的增加而增加,提示糖原合成

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图 3As2O3对小鼠肝脏糖代谢蛋白水平的影响以及牛磺酸的保护作用1~4 mg/kg As2O3处理 C57BL/6J 小鼠 12 周，牛磺酸保护组小鼠在 4 mg/kg As2O3染毒基础上每天用 250mg/kg 牛磺酸进行灌胃。（A）Western blot 检测 GLUT2、GSK3β、p-GSK3β 蛋白表达，以 β-actin 作为内参。（B）GLUT2 蛋白的显影密度分析，GLUT2 相对表达水平以占 β-actin 的百分比来表示。（C）p-GSK3β 蛋白的显影密度分析，p-GSK3β 相对表达水平以占 GSK3β 的百分比来表示。n=3，条图以均值±标准差来表示，* 表示与对照组相比较，P<0.05，** 表示与对照组相比较，P<0.01，#表示与高浓度染毒组相比较，P<0.05，##表示与高浓度染毒组相比较，P<0.01。1.4 As2O3对小鼠肝脏 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表达的影响以及牛磺酸的保护作用PPARγ 和 mTORC2 对调控肝脏糖脂代谢起着重要作用。给予 1~4 mg/kgAs2O3处理后，PPARγ 和 mTORC2 的靶蛋白 p-Akt 蛋白表达与对照组相比均显著下降。与高浓度染毒组相比，牛磺酸保护组中 PPARγ 和 p-Akt 蛋白表达水平均有所增加（如图 4A-C 所示）。组织免疫荧光进一步验证肝组织 p-Akt 的表达，其结果与

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