【摘要】：背景糖尿病肾病(diabetes nephropathy,DN)是糖尿病最为常见的微血管并发症之一。目前,DN的发病复杂,其机制尚不完全清楚。既往认为肾小球损伤是在糖尿病肾病发展为终末期肾病(ESRD)过程中最重要的病理变化。然而,肾小管及肾间质占全部肾脏体积的90%左右,肾小管细胞的损伤在DN发病过程中起着同样重要作用。越来越多的证据表明,在肾小球滤过正常的时候,肾小管性蛋白尿已经可以在尿液中检测到,这就说明肾小管在DN发病机制中独立于肾小球的改变,肾小管细胞受损是DN早期的原始改变,阻断肾小管近端上皮细胞受损更接近于治疗靶点的源头。自噬(autophagy)是细胞通过溶酶体降解自身受损细胞器以及大分子物质的过程,在肾脏疾病中起着重要的作用。自噬分为选择性自噬和非选择性自噬。其中,机体通过选择性自噬清除各种细胞器如线粒体、内质网、过氧化物酶体等,分别称为线粒体自噬、内质网自噬、过氧化物酶体自噬等。正常情况下,细胞自噬功能处于一个正常的基础水平,来维持细胞正常的生理功能。若机体自噬出现异常,则可能会导致肾脏疾病的发生和发展。目前,调控肾小管上皮细胞线粒体自噬的机制不太清楚。叉头状转录调节因子O1(forkhead transcription factors of the O class1)在抗氧化应激、转录翻译、糖脂代谢等方面具有重要作用。本课题组前期研究发现,FoxO1可以调节线粒体自噬,减少ROS的过度释放,进而改善糖尿病足细胞氧化应激损伤。肾小管细胞中的研究发现,高糖会导致肾小管上皮细胞自噬功能的下降,可能与DN的发病机制可能有密切的关系。BNIP3属于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亚家族,研究发现BNIP3可以激活线粒体自噬,既往研究发现在急性肾损伤的肾近曲小管细胞中,FoxOs可以通过下游靶基因Bnip3抑制mTORC1的作用,开始自噬,促进凋亡。由此我们推断,FoxO1/Bnip3通路在糖尿病肾病的肾小管中也可能发挥重要作用。FoxO1可以通过上调Bnip3的表达,启动线粒体自噬,减少损伤。目的:在前期研究工作的基础上,结合国内外最新研究成果,拟通过体内和体外在高糖条件下,观察调节FoxO1的表达对线粒体自噬和在近端肾小管损伤中的影响,并探究其是否通过激活下游BNIP3的表达发挥作用,为DN的防治提供新的思路。方法:动物实验部分,利用雄性C57BL/6野生小鼠和同型FoxO1过表达的转基因小鼠,通过STZ诱导建立糖尿病小鼠模型。实验小鼠分为4组,普通小鼠对照组(NG)、转基因小鼠正常组(TG)、普通糖尿病小鼠(DM)、转基因糖尿病小鼠(TG-DM)。每组各8只。12周末小鼠心脏取血检测血清肌酐、尿素氮;各组代谢笼收集24h尿检测24h尿总蛋白、尿微量白蛋白;尾静脉取血测血糖,小鼠麻醉后,迅速剥离出肾脏,其中放入4%戊二醛中固定用于电子显微镜的检查,置于4%多聚甲醛中固定用于石蜡切片,剩余放入冻存管于液氮中冷冻,Western blot检测FoxO1表达水平及磷酸化状态(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫组化检测FOXO1、BNIP3在各组大鼠肾组织中的表达。透射电镜、HE染色、Massion染色观察肾脏的病理学变化。使用CRISPR/Cas9技术在肾小管上皮细胞上过表达/敲除FoxO1,使用BNIP3 siRNA质粒转染。细胞实验分组如下:(1)正常糖浓度组(NG,5.6mmol/L),(2)高糖(HG,25mmol/L),(3)高糖+FoxO1上调组(HG+KI),(4)Bnip3 siRNA转染组(HG+KI+Bnip3 siRNA)。各组处理后实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组FoxO1、BNIP3、LC3、P62 mRNA的表达水平。Western blot检测FoxO1表达水平及磷酸化状态(p-FoxO1)、BNIP3、LC3、P62的蛋白水平;免疫荧光化学检测各组细胞FoxO1和BNIP3的表达;流式细胞仪检测各组ROS的生成率;检测各组细胞ATP的生产率。。结果:1.小鼠各组肾脏肾小管上皮细胞中FoxO1的表达以及活性的改变,与NG组相比,DM组小鼠肾脏肾小管上皮细胞中FoxO1蛋白水平没有统计学差异(P0.05),p-FoxO1/FoxO1蛋白水平增高(P0.05),与DM组相比,TG-DM组FoxO1蛋白水平增高(P0.05),p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。表示高糖可以诱导FoxO1转录活性下降,转基因小鼠FoxO1上调成功。2.动物验证FoxO1对BNIP3通路的影响,与NG组相比,DM组BNIP3蛋白水平降低,LC3、P62蛋白水平均明显升高(P0.05),与DM组相比,TG-DM组BNIP3蛋白水平升高,LC3、P62蛋白水平均降低(P0.05)。HE和扫描电镜染色显示TG-DM组肾小管结构等病变均较DM组有所减轻。3.细胞各组FoxO1表达以及活性的改变:与NG组相比,HG组FoxO1 mRNA及蛋白水平无明显变化,p-FoxO1/FoxO1水平增高(P0.05)。HG+KI组较HG组FoxO1 mRNA及蛋白水平升高,p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05)。说明高糖可以诱导FoxO1转录活性下降,CRISPR/Cas9技术在肾小管上皮细胞过表达FoxO1成功。4.细胞中FoxO1对BNIP3通路的影响:与NG组相比,HG组BNIP3 mRNA及蛋白水平降低,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均升高(P0.05),与HG组相比,HG+KI组BNIP3 mRNA及蛋白水平升高,LC3、P62 mRNA及蛋白水平均有所降低(P0.05)。转染BNIP3敲除的质粒后,上调FoxO1对上述指标的影响被阻断。5.与NG组相比,HG组明显升高肾小管上皮细胞中ROS水平(P0.05),与HG组相比,HG+KI组可显著抑制高糖的影响(P0.05),转染BNIP3敲除的质粒后,上调FoxO1对上述指标的影响被阻断。结论:(1)高糖能够降低肾小管上皮细胞中FOXO1表达活性,导致线粒体功能障碍,引起细胞内ROS的增加。(2)过表达FoxO1可以明显提高高糖状态下HK-2细胞线粒体自噬水平,降低高糖诱导的线粒体损伤,其机制可能是通过上调BNIP3实现的。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R587.2;R692.9
【图文】：
图 1 各组 HK-2 细胞 FoxO1 及 p-FoxO1 表达A：FoxOl mRNA 相对表达量；B：Western blot 检测 FoxO1 及 p-FoxO1 水平；C: FoxO1 蛋白相对表达水平； D: p-FoxO1/FoxO1 的比值。*表示与 NG 组相比，P<0.05； #表示与 HG 组相比，P<0.05
免疫荧光化学检测各组细胞FoxO1表达*表示与NG组相比，P<0.05；#表示与HG组相比，P<0.05
图 3 各组 HK-2 细胞 BNIP3、P62 和 LC3 mRNA 相对表达量A：BNIP3 mRNA 表达；B：P62 mRNA 表达；C：LC3 mRNA 表达*表示与 NG 组相比，P<0.05； #表示与 HG 组相比，P<0.05；&表示与 HG+KI 组相比，P<0.05
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