stat1a基因CRISPR敲除对斑马鱼早期胚胎骨骼发育的影响研究

发布时间：2020-08-12 23:30

【摘要】：骨质疏松表现为较低的骨密度,是一种容易导致骨折的全身性骨骼疾病,严重影响公众健康,与骨骼发育有密切关系。本研究室早期通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等,发现STAT1基因与骨质疏松密切相关,但不清楚STAT1基因在体调控骨骼发育而导致骨表型改变的作用机制,所以本研究结合分子遗传学手段,选择斑马鱼模型进行在体研究,进一步揭示骨骼发育的分子调控机制,对骨质疏松症的预防、诊断、治疗以及药物开发都有重要意义。斑马鱼与人类在骨骼发育过程中的基因、信号通路有高度同源性,且STAT1基因进化上较为保守,人类STAT1基因的两个不同剪接体STAT1-alpha和STAT1-beta对应于斑马鱼两个不同基因stat1a和stat1b,研究发现stat1a在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且,与其他动物模型相比,斑马鱼个体小、幼鱼通体透明,利于骨骼发育的观察。本文主要通过CRISPR/Cas9基因打靶技术,在斑马鱼stat1a基因上设计合适的打靶位点,将体外合成的特异性sgRNA(终浓度20ng/μL)和Cas9-mRNA(终浓度300 ng/μL)显微共注射进斑马鱼一细胞内,并通过活性检测证实了所选位点的有效性。对F0代斑马鱼提取基因组DNA后进行T7E1酶切检测以及Sanger测序,成功筛选到2条stat1a基因突变的F0代斑马鱼。在F1代受精后20天、30天和47天,随机挑取两个突变体的F1代斑马鱼和野生型斑马鱼各10条,测量其长度,发现突变体F1代斑马鱼要比野生型生长速度更快。结果与小鼠stat1-/-敲除研究发现骨密度与骨量增加一致,提示stat1可能通过抑制成骨细胞生成影响骨骼发育。目前,已经从F2代胚胎中鉴定到stat1a突变体纯合子。用Phyre软件预测F1代突变体STAT1蛋白质空间结构时发现,其二级结构的某些保守结构域位点发生改变。STAT1蛋白的V638和S639处是同源二聚体界面,对应于F1代突变体的这两个氨基酸位点,V630和S631却不再是同源二聚体接触面。可能是由于stat1a基因突变影响STAT1同源二聚体的结合,影响骨骼的生长发育,从而导致斑马鱼生长更快。为进一步分析stat1a基因敲除后的变化,利用不同浓度STAT1抑制剂磷酸氟达拉滨(Fludarabine)处理斑马鱼胚胎10天,发现随浓度增加死亡率也随之增加。低于5μg/mL浓度组的死亡率低于10%,10μg/mL、20μg/mL以及40μg/mL浓度组死亡率达到30%-40%,而50μg/mL浓度组从处理第5天开始,死亡率接近70%。从处理第3天开始,实验组斑马鱼陆续出现轻微或严重畸形,且随处理浓度增大,畸形鱼的死亡率增加,且死亡的斑马鱼绝大部分是畸形鱼。氟达拉滨可抑制STAT1表达,而STAT1抑制成骨细胞分化,出现畸形可能是由于STAT1的抑制引起破骨细胞、成骨细胞生理功能失衡而导致骨骼发育异常,最终产生骨表型的改变。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R580;Q344
【图文】：

斑马鱼,结构域,基因,同源性

1.1.3.2 斑马鱼 stat1a、stat1b 基因与人类 STAT1 基因的同源性从GeneBank检索表明斑马鱼stat1有两个基因分别为stat1a与stat1b，与人类STAT1基因有很高的同源性，下图1-1表示该基因及其编码的蛋白与人类STAT1基因的相似性和差异[36]。与人类STAT1基因外显子相比，斑马鱼stat1a、stat1b基因具有很高同源性，只缺少第一个不参与翻译的外显子。人类STAT1-alpha和斑马鱼Stat1a有五个相同的保守结构域，包括N端的STAT二聚体作用稳定结构域（STAT_int）、卷曲螺旋结构域（STAT_alpha）、DNA结合结构域（DBD或STAT_bind）、磷酸酪氨酸结合SH2结构域（SH2）以及C端反式激活结构域（TAD或STAT_TAZ2bind），而STAT1-beta与Stat1b缺少TAD结构域。斑马鱼和人STAT1基因编码的蛋白质的SH2域高度保守，相似性达82 %，DNA结构域相似性有73 %[37]。除了这几个结构域相似，斑马鱼Stat1a和Stat1b蛋白也保有某些STAT1功能必需的氨基酸残基。人类STAT1蛋白中

家牛,野猪,非洲爪蟾,水牛

6图 1-2 STAT1 蛋白的氨基酸比对注：Rattus：大鼠，Mus：小鼠，Bos：家牛，Bubalus：水牛，Ovis：绵羊，Capra：山羊，Sus：野猪，Homo：人类，Xenopus：非洲爪蟾蜍。保守氨基酸残基已标亮突出。引自文献 DOI 10.1007/s11250-014-0682-6[38].1.1.3.4 斑马鱼 stat1a、stat1b 基因与人类 STAT1 基因功能相似性功能相似性主要表现在斑马鱼等硬骨鱼类干扰素通路也是通过stat1介导的[40]。早有研究阐明了 stat1 功能的保守性，人的细胞株中 STAT1 基因缺失后可以用过量表达斑马鱼 stat1a 基因恢复正常的 IFN 信号[41]。因此，对斑马鱼 stat1 作用机制的

序列,斑马鱼,心脏发育,生活条件

本实验中所用斑马鱼均为野生型 AB 品系，来自中国科学院水生生物研究养殖基地，由项目研究主持单位湖南师范大学生命科学学院心脏发育研究授提供。按照斑马鱼适宜生活条件，在斑马鱼房中进行饲养、繁殖与培育马鱼均在自动水循环系统中饲养，将温度稳定在 28.5 ± 0.5 ℃，每日固定 14 h。.2 CRISPR/Cas9 基因敲除靶位点设计在 National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼的基因组 DNA 序列及其功能结构域，根据 CRISPR/Cas 敲除原理，在网T Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT_Cas9) 上设计一对stat1a基因的靶的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中 5’ 端的 GG 二核苷动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的GG。靶点的选择必须确保靶点位置碱基的插入或者缺失可以影响 stat1个结构域，从而改变基因的表达。

【参考文献】