系统性红斑狼疮B细胞亚群特点及免疫组库分析

发布时间：2020-08-18 12:12

【摘要】：系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种病因未明的慢性全身性自身免疫性疾病,以B细胞免疫耐受破坏、产生大量自身抗体为特征,最终免疫复合物沉积于组织、器官从而导致损伤。我国SLE患病率约为0.7~1/1000,且女性的发病率远高于男性。尽管各类固有免疫和适应性免疫细胞共同参与SLE的发病机制,根据目前小鼠和人的研究,B细胞免疫耐受破坏与自身反应性B细胞异常激活仍是SLE发病的核心致病因素。SLE患者体内B细胞亚群比例失调,免疫稳态存在紊乱,检测其外周血B细胞亚群的比例和功能状态,可以深入探讨不同B细胞亚群在SLE发病中的作用。SLE患者体内存在大量的自身反应性抗体分泌细胞(Antibody secreting cells,ASC)和高水平的自身抗体,并且ASC细胞的比例扩增会引起SLE疾病活动度的增高,然而这种致病性ASC细胞的来源和产生过程目前仍不清。无能B细胞(人外周血中的无能B细胞称为B_(ND)细胞)是初始B细胞中富含自身反应性的一个亚群,其通过下调表面免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)M来避免接受抗原刺激,从而达到免疫“无能”的状态。此外,其胞内的蛋白磷酸化水平和钙流反应性处于抑制状态。多项研究表明无能B细胞在自身免疫疾病中缺失,提示着这群细胞可能发生激活并得到进一步分化。无能B细胞很可能是SLE患者致病性ASC细胞的潜在危险来源。免疫组库测序(Adaptive immune receptor repertoire sequencing,AIRR-seq)是研究B细胞特征和抗体谱特点的重要方法,通过高通量测序方法分析B细胞受体(B cell receptor,BCR)序列可以探究适应性免疫谱多样性、克隆扩增和免疫谱成熟过程,进一步加深对SLE中异常免疫反应的了解,也有助于寻找致病性的B细胞亚群。然而SLE患者体内B细胞亚群的免疫组库仍缺乏研究,IgM~-的B_(ND)细胞、IgM~+的初始B细胞(Conventional Na?ve B cells,CN B)免疫组库特点和类型转换的记忆B细胞(Switch Memory B cell,SM B)以及ASC细胞关系仍然未知。自身反应性B细胞如何被激活并转化为ASC细胞仍是有待于解决的重要难题。本课题首先通过流式细胞术检测SLE患者B细胞亚群比例及其功能状态,探讨各B细胞亚群在SLE发病中的意义。其次,通过分选IgM~+的CN B细胞、IgM~-的B_(ND)细胞、SM B细胞以及ASC细胞。并对4个B细胞亚群进行免疫组库分析,进而探讨SLE中4种细胞亚群的相互关系,协助寻找SLE中的致病性细胞产生来源和转化过程。第一章SLE患者外周血中B细胞亚群的比例与功能研究目的:研究SLE患者B细胞不同亚群的比例与功能特点。方法:1.密度梯度离心法分离61例SLE患者和61例健康对照的外周血单个核细胞(Peripheral blood monocyte cells,PBMC),采用流式细胞术标记不同B细胞亚群表面标记,对各细胞亚群比例进行统计分析,并进行临床相关性分析。2.采用流式细胞术,检测不同B细胞亚群表面CD21、CD40、CD80、CD24、CD95、CD183、白介素4受体(Interleukin 4 receptor,IL-4R)、B细胞激活因子受体(B-cell activating factor,BAFF-R)的表达。3.使用MitoTracker?Green探针标记B细胞活化线粒体,判断不同B细胞亚群线粒体活化状态。4.检测初始B细胞(CN B、B_(ND))在BCR刺激情况,胞内钙流水平的变化。结果:1.SLE患者B细胞亚群紊乱,双阴性B细胞(Double negative B cell,DN B)、ASC、过渡性B细胞(Transitional B cells,Tr B)比例相对健康对照增多,非类型转换的记忆B细胞(Unswitch-Memory B cells,UM B)、B_(ND)细胞比例相对健康对照比例减少,而初始B细胞、CN B、SM B细胞比例相对健康对照差异无统计学意义。2.ASC细胞比例与系统性红斑狼疮活动度指数(Systemic lupus erythematosus activityindex,SLEDAI)、抗双链DNA(Double-strand DNA,dsDNA)抗体滴度均呈显著正相关,B_(ND)细胞比例与SLEDAI、抗dsDNA滴度均呈显著负相关,Tr B细胞比例与抗dsDNA滴度呈显著负相关。3.B_(ND)细胞相对CN B细胞活化标志物CD21、CD80、CD95、CD183水平表达降低,CD40、BAFF-R表达相似,而IL-4R表达增加。4.SLE患者初始B细胞(CN B、B_(ND))相对健康对照线粒体活化程度增加。5.SLE患者B_(ND)细胞钙流反应相对健康对照增加。结论:SLE患者B_(ND)细胞比例相对健康对照降低,且与SLEDAI、抗dsDNA滴度呈显著负相关,是一群有重要临床意义的细胞亚群。此外,SLE患者B_(ND)细胞相对健康对照线粒体活化程度增加、钙流反应增加,表明SLE患者B_(ND)细胞功能活化且对抗原刺激反应性增高,提示SLE患者的B_(ND)细胞可能由于功能活化,存在一定程度的激活,引起比例减少。第二章SLE患者CN B、B_(ND)、SM B和ASC细胞亚群免疫组库分析。方法:1.密度梯度离心法分离7例SLE患者和7例健康对照的PBMC,采用流式细胞术标记不同B细胞亚群表面标记。2.根据表面标记,流式分选SLE患者和健康对照的IgM~+CN B、IgM~-B_(ND)、SM B和ASC细胞。3.Trizol法抽提不同细胞群RNA,进行反转录,并对重链进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增,对PCR产物进行鉴定,回收目的片段条带,对目的片段再次进行PCR扩增。4.对PCR产物进行二代测序,测序数据采用MIXCR和VDJtool软件进行序列比对和统计分析。结果:1.健康人群CN B和B_(ND)细胞具有相似的IGHV基因,CN B、B_(ND)细胞IGHV4-34基因使用率均显著高于SM B、ASC细胞;SLE患者SM B、ASC细胞相对健康对照IGHV4-34基因使用率增高。2.健康人群CN B细胞IGHJ6基因使用率低于B_(ND)细胞,CN B、B_(ND)细胞IGHJ6基因使用率均显著高于SM B、ASC细胞;SLE患者B_(ND)细胞相对健康对照IGHJ6使用率减少,而ASC细胞相对健康对照增加。3.健康人群CN B细胞的互补决定区3(Complementary decision region 3,CDR3)长度短于B_(ND)细胞,CN B、B_(ND)细胞CDR3长度均长于SM B、ASC细胞。SLE患者B_(ND)细胞相对健康对照CDR3长度减少,而SM B细胞相对健康对照增加。结论:健康人群中B_(ND)细胞相对CN B细胞自身反应性增加,表现在更高的IGHJ6基因使用率和更长的CDR3长度。从初始B细胞(CN B、B_(ND))转变为SM B、ASC细胞,机体的免疫耐受检查点会对自身反应性B细胞筛选,导致IGHV4-34基因使用率下降、IGHJ6基因使用率下降以及CDR3长度减少。我们的结果证明:SLE患者体内免疫耐受检查点缺陷,B_(ND)细胞亚群IGHJ6基因使用率低于健康对照、CDR3长度减少。而SM B和ASC细胞亚群IGHJ6、长CDR3等自身反应性序列增加。提示部分B_(ND)亚群中的自身反应性B细胞在SLE患者体内可能发生激活,转换为SM B或ASC细胞,成为致病性B细胞。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.241
【图文】：

细胞,方法,计量资料,两两比较

呈正态分布且方差齐性的计量资料以 x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA检验，组间进一步两两比较采用Dunnt’t检验；偏态分布计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验，组间进一步两两比较采用Dunn's多重检验。相关性分析采用Spearman相关分析。检验水准（α）为0.05。五、实验结果（一）B 细胞亚群流式设门方法在 CD19+的 B 细胞中，可根据 CD27 和 IgD 分为 CD27-IgD+初始 B 细胞、CD27+IgD+UM B 细胞、CD27-IgD-DN B 细胞、CD27+IgD-B 细胞。初始 B 细胞中根据 CD24 和 CD38 的表达划分出 CD24hiCD38hiTr B 细胞与成熟初始 B 细胞，成熟的初始 B 细胞再根据 IgM 的表达分为 IgM+初始 B 细胞 (Conventional Na ve B cells,CN B)、IgM-的 BND细胞。CD27+IgD-的 B 细胞中根据 CD38 的表达划分为 CD27+IgD-SM B 细胞和 CD27+CD38++ASC 细胞。B 细胞各亚群层次关系如图右。

抗dsDNA抗体,相关性分析,滴度,患者

图 3. SLE 患者各 B 细胞亚群比例与 SLEDAI、抗 dsDNA 抗体滴度相关性分析（A）SLE 患者各 B 细胞亚群与 SLEDAI 相关性分析。（B）SLE 患者各 B 细胞亚群与抗 dsDNA 抗体滴度相关性分析。（四）BND细胞亚群表型特点BND细胞是成熟的初始 B 细胞富含自身反应性的细胞亚群，为了避免其激活，机体存在一种“无能”的机制，来降低表面 IgM 型 BCR。上述结果证明，BND细胞在 SLE患者发病中具有重要的意义。因此我们进一步分析 BND细胞亚群的表型特点。结果显示：IgM-BND细胞相对 IgM+CN B 细胞低表达 CD21、CD80、CD95、CD183 等活化CD 分子，具有相对低活化的特征。CD40 和 BAFF-R 与 CN B 表达量相似，表明其具有一定被共刺激分子和 BAFF 细胞因子活化的能力，而其 IL-4R 表达量相对 CNB 细胞增高，提示 BND细胞可能易受 IL-4 的影响。

程度分析,线粒体,患者,亚群

- 27 -图5. SLE患者各B细胞亚群线粒体活化程度分析（A）SLE患者和健康对照各B细胞亚群T-SNE图，每个点代表一个细胞，不同颜色代表不同亚群细胞，不同亚群聚集代表其CD分子特征相似（B）SLE患者和健康对照各

【相似文献】