二甲双胍对多囊卵巢综合征卵巢颗粒细胞胰岛素受体底物-1及其磷酸化表达的影响
发布时间：2020-08-21 21:43
【摘要】：目的1.体外分离培养多囊卵巢综合征(PCOS)和非PCOS患者黄素化颗粒细胞并用卵泡刺激素受体(FSHR)免疫荧光鉴定;2.探讨二甲双胍(Met)对PCOS黄素化颗粒细胞胰岛素受体底物-1(IRS-1)及p-ser307-IRS-1的信使核糖核酸(m RNA)及蛋白表达水平的影响。方法分离纯化体外培养的PCOS和非PCOS组黄素化颗粒细胞用FSHR免疫细胞化学染色鉴定;添加Met处理培养为实验组,添加类胰岛素生长因子-1(IGF-1)为阳性对照组,15%FBS-M199培养基中加入与Met等量PBS培养为阴性对照组;通过RT-PCR和real-time PCR检测分析IRS-1m RNA的表达,细胞免疫荧光化学方法定性和Western-Blot定量检测分析IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达。SPSS17.0统计软件处理如果p0.05表示差异有显著意义。结果1.FSHR蛋白免疫细胞化学染色是鉴定颗粒细胞的特异性标记物,FSHR阳性染色定位于细胞胞浆和细胞膜,呈绿色荧光,细胞核呈蓝色荧光,镜下可见FSHR的阳性率大于95%;2.RT-PCR法扩增出IRS-1的片段大小为134bp,real-time PCR分析结果显示添加Met对PCOS组黄素化颗粒细胞IRS-1 m RNA表达显著下调,与阳性及阴性对照组比较差异有统计学意义(p0.05);3.细胞免疫荧光化学检测IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白阳性表达定位在颗粒细胞细胞质;4.Western-blot检测Met作用24h后卵巢黄素化颗粒细胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达下调,差异有统计学意义(p0.05),灰度值分析结果显示PCOS组卵巢黄素化颗粒细胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达高于非PCOS组,添加Met组作用24h后PCOS组黄素化颗粒细胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表达较非PCOS组显著性下降(p0.05)。结论1、FSHR蛋白免疫荧光化学染色阳性率大于95%,卵泡液分离黄素化颗粒细胞培养的纯度达到95%以上2、PCOS患者卵巢颗粒细胞IRS-1及其磷酸化表达上升3、Met降低PCOS患者卵巢颗粒细胞IRS-1及其磷酸化的表达
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.75
【图文】：
图 1 胰岛素的信号转导示意图Figure1.Insulin Signaling Pathway有研究【7】发现 PCOS 的 IR 不仅存在于脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌细胞等胰岛素经典靶细胞，也存在于某些非经典靶细胞,成纤维细胞和红细胞，甚至卵巢颗粒细胞等。PCOS 患者组织和细胞因为存在 InsR 活性低下、IRS-1 磷酸化表达异常、细胞膜糖转运蛋白-4（GLuT4）表达低于正常等信号因子异常，从而引起 IR，导致葡萄糖摄取率下降【6】。PCOS 患者的卵巢黄素化颗粒细胞，通过胰岛素增敏剂(二甲双胍 Metformin、Met)可以纠正细胞糖原胰岛素合成抵抗状态，【7】已被研究证明。体外培养的 PCOS 卵巢黄素化颗粒细胞，胰岛素外源刺激减少葡萄糖代谢产物乳酸的产生，增加丙酮酸消耗，提示卵巢颗粒细胞胰岛素的作用机制受损【8】。1．PCOS 与 IR
素抵抗【17】。Met 直接作用于卵巢的卵泡膜颗粒细胞，合成类固醇激激素的产生；激活 PCOS 外周组织细胞的胰岛素敏感性，降低血清胰制抗氧化剂诱导高雄激素合成而降低雄激素水平。研究报道：正常培养时添加 Met，抑制颗粒细胞分泌雄烯二酮 A2、雌二醇（E2）和孕的卵泡膜肿瘤细胞体外培养基中加入 50uMol 的 Met 能够抑制（A2）的膜细胞雄激素合成酶 CYP17mRNA 及其蛋白的表达[18]。Met 上调信号传导分子磷酸化蛋白激酶（AKT）和下调促有丝分裂激活蛋蛋白的表达，促进颗粒细胞增殖，减少凋亡。培养时添加 Met（10卵巢的颗粒细胞 E2和 P 的分泌，降低类固醇激素酶的合成【20】。由上AMPK1 信号传导通路降低类固醇激素的合成，而不完全依赖于胰岛见图 2）。
二甲双胍对卵巢黄素化颗粒细胞 IRS-1 及其磷酸化表达的影响检测.1 实验分组PCOS 患者和非 PCOS 患者卵巢黄素化颗粒细胞分别体外培养：实验组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加 Met 100umol/L；阳性对照组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加添加 IGF-1 0.1mg/ml；阴性对照组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加与药物等量 1×PBS100uL。体外分离所得人卵巢黄素化颗粒细胞用于细胞免疫荧光检测 IRS-1 及 p-IRS-达的细胞进行细胞爬片培养；剩余细胞以相应密度接种于六孔板中，用于 RT- Western-blot 检测黄素化颗粒细胞中 IRS-1 及 p-IRS-1 的表达；所有细胞按实验养 24h 后进行相关检测。
本文编号：2799895
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.75
【图文】：
图 1 胰岛素的信号转导示意图Figure1.Insulin Signaling Pathway有研究【7】发现 PCOS 的 IR 不仅存在于脂肪细胞、肝细胞、骨骼肌细胞等胰岛素经典靶细胞，也存在于某些非经典靶细胞,成纤维细胞和红细胞，甚至卵巢颗粒细胞等。PCOS 患者组织和细胞因为存在 InsR 活性低下、IRS-1 磷酸化表达异常、细胞膜糖转运蛋白-4（GLuT4）表达低于正常等信号因子异常，从而引起 IR，导致葡萄糖摄取率下降【6】。PCOS 患者的卵巢黄素化颗粒细胞，通过胰岛素增敏剂(二甲双胍 Metformin、Met)可以纠正细胞糖原胰岛素合成抵抗状态，【7】已被研究证明。体外培养的 PCOS 卵巢黄素化颗粒细胞，胰岛素外源刺激减少葡萄糖代谢产物乳酸的产生，增加丙酮酸消耗，提示卵巢颗粒细胞胰岛素的作用机制受损【8】。1．PCOS 与 IR
素抵抗【17】。Met 直接作用于卵巢的卵泡膜颗粒细胞，合成类固醇激激素的产生；激活 PCOS 外周组织细胞的胰岛素敏感性，降低血清胰制抗氧化剂诱导高雄激素合成而降低雄激素水平。研究报道：正常培养时添加 Met，抑制颗粒细胞分泌雄烯二酮 A2、雌二醇（E2）和孕的卵泡膜肿瘤细胞体外培养基中加入 50uMol 的 Met 能够抑制（A2）的膜细胞雄激素合成酶 CYP17mRNA 及其蛋白的表达[18]。Met 上调信号传导分子磷酸化蛋白激酶（AKT）和下调促有丝分裂激活蛋蛋白的表达，促进颗粒细胞增殖，减少凋亡。培养时添加 Met（10卵巢的颗粒细胞 E2和 P 的分泌，降低类固醇激素酶的合成【20】。由上AMPK1 信号传导通路降低类固醇激素的合成，而不完全依赖于胰岛见图 2）。
二甲双胍对卵巢黄素化颗粒细胞 IRS-1 及其磷酸化表达的影响检测.1 实验分组PCOS 患者和非 PCOS 患者卵巢黄素化颗粒细胞分别体外培养：实验组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加 Met 100umol/L；阳性对照组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加添加 IGF-1 0.1mg/ml；阴性对照组：细胞培养至 2h 后贴壁生长时添加与药物等量 1×PBS100uL。体外分离所得人卵巢黄素化颗粒细胞用于细胞免疫荧光检测 IRS-1 及 p-IRS-达的细胞进行细胞爬片培养；剩余细胞以相应密度接种于六孔板中，用于 RT- Western-blot 检测黄素化颗粒细胞中 IRS-1 及 p-IRS-1 的表达；所有细胞按实验养 24h 后进行相关检测。
【参考文献】
相关期刊论文 前5条
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3 庄广伦;李轶;梁晓燕;;卵泡发育的基本理论及促超排卵[J];实用妇产科杂志;2007年03期
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5 包扬;包影;朴春丽;何泽;;多囊卵巢综合征胰岛素抵抗与非胰岛素抵抗治疗的临床疗效对照分析[J];中国妇幼保健;2014年30期
本文编号：2799895
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