MuSK荧光蛋白的制备及rapsyn基因多态性在重症肌无力的研究

发布时间：2020-08-23 16:33

【摘要】：第一部分MuSK-mCherry融合荧光蛋白的构建及对重症肌无力患者MuSK抗体的检测目的：构建肌肉特异性激酶(MuSK)与红色荧光蛋白(mCherry)的重组融合蛋白(MuSK-mCherry),并作为抗原用于重症肌无力(MG)患者血清中的MuSK抗体的检测。方法：首先通过PCR扩增pRSET-B载体中的mCherry基因,扩增后的mCherry基因经加A尾后克隆至T载体(pGEM-T Easy Vector),并将克隆载体转化至E coli DH5α细胞株。纯化提取质粒经Age Ⅰ酶切后,克隆至含MuSK细胞外区基因的载体pMT/BiP/V5-His (MuSK)上,连接mCherry基因与人MuSK细胞外区第22～452位氨基酸肽段基因,并将连接基因转化至E coli DH5a细胞株,以构建MuSK-mCherry融合荧光蛋白基因。其次,将制备的上述重组载体转染果蝇S2细胞,采用共聚焦显微镜检查表达出的MuSK-mCherry融合荧光蛋白。最后,以MuSK-mCherry融合蛋白检测MG患者血清中MuSK抗体。结果：成功地构建了MuSK-mCherry融合蛋白基因,并得到了表达。经对已知MuSK抗体阳性的MG患者血清中的MuSK抗体的检测证实,构建的MuSK-mCherry融合蛋白在荧光免疫沉淀试验中可以检测到MuSK抗体。结论：以MuSK细胞外肽段与mCherry构建的融合荧光蛋白作为抗原,可以用于MG患者血清中的MuSK抗体的检测。第二部分rapsyn基因外显子区多态性与重症肌无力相关性研究目的：研究重症肌无力(MG)与突触受体相关蛋白(rapsyn)外显子基因单核苷酸多态性(SNPs)之间的相关性。方法：采用PCR方法扩增MG患者组(132例)以及正常对照组(153例)外周血中提取的DNA中rapsyn基因的8个外显子,并测序。测序结果与NCBI SNPs数据库中野生型rapsyn基因序列(GenBank No. Z33905)进行比较,分析rapsyn基因8个外显子区SNPs。运用SHEsis在线软件进行等位基因、基因型频率计算、Hardy-Weinberg遗传平衡检验,进行病例-对照关联分析,查找rapsyn基因突变位点以及MG临床症状与rapsyn基因突变之间的相关性。结果：rapsyn基因的第1、2、4、5、6、7、8等7个外显子测序结果与野生型基因序列吻合,未发现有基因突变。第3外显子中发现新SNP:L222R[CTGCGG(2)]或T665G。SNP L222R等位基因频率和基因型频率在患者组和对照组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P0.05),具有群体代表性。G等位基因频率在患者组和对照组之间无统计学差异(P0.05),3种基因型TT、TG、GG在患者组(42.4%V48.5%V9.1%)和对照组(49.0%V33.3%V17.6%)存在显著性差异(P0.05),并且携带GG基因型对照组显著高于患者组(P0.05),表现为隐性模型特征。结论：rapsyn基因第三外显子L222R (T665G)是MG新的SNP,该SNP与MG遗传易感性存在相关性;G等位基因可能是MG的保护因子。
【学位授予单位】：延边大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R746.1

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本文编号：2801757