NUCB2对大鼠肝糖代谢的影响与机制研究

发布时间：2020-08-23 17:15

【摘要】：第一部分NUCB2基因敲除对大鼠肝糖代谢的影响与机制研究目的:探讨NUCB2基因敲除对高脂喂养大鼠肝糖代谢的影响,并初步研究NUCB2对肝糖代谢的影响机制。方法:将由杂合子与杂合子繁殖的同窝6周龄野生型(WT)与纯合子(NUCB2~(-/-))健康雄性大鼠,分别进行普食(ND)和高脂(HFD)喂养,即分为ND-WT、ND-NUCB2~(-/-)、HFD-WT、HFD-NUCB2~(-/-)四组,喂养12周并每周测定体重,12周后分别测定肛温、摄食、空腹与餐后血糖,并进行GTT、ITT和高胰岛素正葡萄糖钳夹实验,分析NUCB2基因敲除对大鼠肝糖代谢的影响。将四组大鼠的肝组织进行转录组测序分析,分析NUCB2基因敲除对糖代谢相关因子的影响,对产生表达变化的因子进行进一步的Q-PCR和Western blot以证实其检测结果。再检测各组大鼠肝组织mRNA与蛋白表达水平,进行Q-PCR和Western blot实验,分析糖异生相关因子(PEPCK、G6Pase)、糖酵解相关因子(Gck、PKLR)、糖原合成相关因子(GSK3β)的表达变化情况,检测糖代谢信号通路IR/IRS/AKT的表达差异。结果:在分组喂养12周后,HFD组NUCB2~(-/-)大鼠的体重、摄食量较WT增加,肛温则降低(P0.05或P0.01);FBG、PBG、GTT、ITT与高胰岛素正葡萄糖钳夹实验结果均显示NUCB2基因敲除组较对照组胰岛素抵抗增加(P0.05或P0.01);肝组织的转录组测序分析显示NUCB2基因敲除大鼠较对照组的糖有氧氧化相关基因PDK4表达增加;NUCB2基因敲除大鼠较对照组肝糖异生相关因子PEPCK、G6Pase表达增加,糖酵解相关因子Gck、PKLR与糖原合成相关因子GSK3β表达降低,IR/IRS/AKT信号通路的磷酸化水平降低。结论:NUCB2基因敲除可增加大鼠高脂诱导的胰岛素抵抗。第二部分NUCB2对肝细胞糖代谢的影响与机制研究目的:探讨NUCB2对大鼠原代肝细胞糖代谢的影响与机制。方法:用游离脂肪酸(FFAs)对NUCB2-/-和野生型大鼠原代肝细胞进行诱导,造成肝细胞胰岛素抵抗模型。利用海马XF糖酵解速率分析(Glycolytic Rate Assay,GRA)分析NUCB2-/-和WT大鼠原代肝细胞在糖酵解上的差异,通过细胞线粒体压力测试(Cell Mito Stress Test,MST)分析各组细胞有氧氧化能力的不同。再检测各组原代肝细胞m RNA与蛋白表达,进一步分析NUCB2-/-和对照组之间PDK4、PEPCK、G6Pase、Gck、PKLR、p-GSK3β等的表达差异,验证NUCB2在肝细胞中对IR/IRS/AKT的表达活性影响。结果:在NUCB2-/-和WT大鼠原代肝细胞成功诱导胰岛素抵抗模型。在海马XF细胞线粒体压力测试(Cell Mito Stress Test,MST)和糖酵解速率分析(Glycolytic Rate Assay,GRA)实验中发现NUCB2-/-原代肝细胞较对照组的有氧氧化能力与糖酵解均降低(p0.05或p0.01)。在进一步的m RNA与蛋白表达检测中,NUCB2-/-大鼠原代肝细胞较对照组PEPCK、G6Pase、PDK4表达增加,Gck、PKLR、p-GSK3β表达降低,IR/IRS/AKT信号通路的磷酸化水平降低。结论:NUCB2基因敲除可降低肝细胞有氧氧化与糖酵解能力,增加肝细胞FFAs诱导的胰岛素抵抗。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589
【图文】：

鉴定结果

计软件 SPSS7.0 分析结果，以平均值和标准误（Mean±SE）表示；采用 t 检验进行组间分析，P<0.05 有意义。果因敲除大鼠的鉴定分型赛业生物科技有限公司构建引入 NUCB2+/-大鼠，在重庆医科大学实验动养，通过一对一繁殖，半定量 PCR 分型鉴定子代，采用两组鉴定引物。物鉴定结果中，只有一条 630bp 的条带为阳性纯合子（-/-）或杂合子（+/-1335bp 的 WT 链可能扩增不出；只有一条 1335bp 的条带为 WT（+/+）335bp 和 630bp 条带的为+/-。第二组引物鉴定结果中，只有一条 672bp 条+或+/-，无条带为-/-。鉴定结果如图 3.1 所示。

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重庆医科大学硕士研究生学位论文 12 周的大鼠基础指标图所示，6 周龄的野生型和 NUCB2-/-大鼠在经过 12 周的饮食诱重明显高于 ND 组。从第 10 周开始，HFD 组中 NUCB2-/-鼠的体5 或 P<0.01)，如图 3.2.1。在造模满 12 周时，NUCB2-/-大鼠与造重改变较 WT 组大(P<0.01)，如图 3.2.2。在普食组中，NUCB2-/- 12 周后的体重略高于 WT 大鼠，但是该差别无统计学意义。

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图 3.2.2 体重改变Figure 3.2.2 Body weight change **p<0.01 vs. HFD-WT型和 NUCB2-/-大鼠在造模 12 周完成后，摄食测量中，高脂（HF鼠的摄食高于 WT 大鼠(P<0.05)，如图 3.2.3 所示，而普食组无的肛温测量中，NUCB2-/-大鼠与 WT 大鼠相比降低(P<0.05)，如图食组无明显差异。

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