GHR低表达对FFA诱导脂肪细胞炎症因子表达和分泌的影响及其作用机制

发布时间：2020-08-26 02:14

【摘要】：【目的】探讨3T3-L1脂肪细胞生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)对游离脂肪酸(free fat acid,FFA)诱导脂肪细胞炎症因子表达和分泌的影响及其作用机制。【方法】(1)诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,待分化呈90%成熟脂肪细胞表型,采用siLentFect脂质转染试剂介导siRNA沉默脂肪细胞GHR的表达。细胞转染24h后,Western blot检测si RNA-GHR的沉默效率。(2)分别用0mM、0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM FFA处理3T3-L1脂肪细胞30min、60min、120min、240min,MTT试剂盒检测各组细胞活力变化,分析计算FFA最佳处理时间和浓度。(3)荧光实时定量PCR技术检测沉默GHR表达对FFA诱导的3T3-L1脂肪细胞肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白-1α(monocyte chemoattractant protein-1α,MCP-1α)、巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)mRNA表达水平;ELISA检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌水平。(4)采用双荧光素酶报告基因系统分析沉默GHR表达对FFA诱导3T3-L1脂肪细胞NF-κB转录活性的影响。(5)Western blot检测沉默GHR表达对FFA诱导3T3-L1脂肪细胞NF-κB炎症信号通路分子表达的影响。(6)通过特异性激动剂Forskolin(FK)或抑制剂Okadaic Acid(OA)分别增强或抑制蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的活性,采用双荧光素酶报告基因系统分析NF-κB的转录活性、Western blot检测NF-κB炎症信号通路分子的表达水平,观察沉默GHR表达对FFA激活3T3-L1脂肪细胞NF-κB炎症信号通路的影响。【结果】(1)特异性siRNA-GHR转染3T3-L1脂肪细胞后,siRNA-GHR组GHR的表达水平较siRNA-control组下降85.1%(P0.05,差异具有显著性)。(2)0.05mM和0.1mM FFA分别处理细胞30min、60min、120min、240min及0.5mM FFA处理细胞30min、60min、120min后,细胞活力较对照组均无明显变化(P0.05,差异无显著性);0.5mM FFA处理细胞240min及1.0mM FFA处理细胞30min、60min、120min、240min后,细胞活力较对照组明显下降(P0.05,差异具有显著性)。(3)3T3-L1脂肪细胞经0.5mM FFA处理30 min、60 min、120 min后,TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因mRNA的表达水平较对照组显著升高(P0.05,差异具有显著性)。沉默3T3-L1脂肪细胞GHR的表达后,FFA诱导细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因mRNA的表达水平较对照组显著降低(P0.05,差异具有显著性)。(4)0.5mM FFA处理细胞30min、60min、120min后,细胞培养液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平较对照组显著升高(P0.05,差异具有显著性);沉默3T3-L1脂肪细胞GHR的表达后,细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6的水平较对照组显著降低(P0.05,差异具有显著性)。(5)FFA诱导细胞NF-κB转录活性增强。随着FFA处理浓度的增加,NF-κB的转录活性逐渐增强(P0.05,差异具有显著性);而沉默GHR的表达能够显著降低FFA诱导的3T3-L1脂肪细胞NF-κB转录激活(P0.05,差异具有显著性)。(6)3T3-L1脂肪细胞经0.5mM FFA处理120min后,炎性激酶IKKβ和NF-κB磷酸化水平明显增加;而沉默脂肪细胞GHR的表达可显著降低磷酸化IKKβ和NF-κB p65的过度表达(P0.05,差异具有显著性)。(7)0.5mM FFA分别处理细胞30min、60min、120min后,PP2Ac蛋白表达水平均无明显变化,但PP2Ac活性受到明显抑制(P0.05,差异具有显著性);而沉默GHR表达能够显著改善FFA对细胞PP2A活性的抑制作用(P0.05,差异具有显著性)。(8)沉默GHR表达能够抑制FFA诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症信号通路相关蛋白的活化。且PP2A激活剂FK能够进一步增强此效应,但PP2A抑制剂OA能够部分逆转此效应。【结论】沉默GHR表达通过PP2A/IKKβ/NF-κB信号通路拮抗FFA诱导3T3-L1脂肪细胞炎症因子的表达和分泌。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R589.2
【图文】：

第 4 章 实验结果第 4 章 实验结果HR 对 3T3-L1 脂肪细胞 GHR 的沉默效R 对 3T3-L1 脂肪细胞 GHR 的沉默效率，实验将 siRNA duplex-GHR（si-GHR）或 scramble n 脂肪细胞 24 h，换完全培养基继续培养 48 h，结果如图 4.1 所示，与 si-Ctrl 组比较，siRNA-G<0.05，差异具有显著性）。

图 4.2 FFA 处理对 3T3-L1 脂肪细胞活力的影响（* P<0.05，与处理时间相同，但无 FFA 处理的细胞组比较，n=3）.3 沉默GHR表达对FFA诱导的3T3-L1脂肪细胞炎症细胞因子mRN达的影响将 si-GHR 或 si-Ctrl 转染 3T3-L1 脂肪细胞 24 h 后，换完全培养基继续培养 48 h，用 0.5mM FFA 分别处理 3T3-L1 脂肪细胞 30min,60min,120min 后用荧光实时定量 PC术检测炎症细胞因子 TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α mRNA 表达的变化。如图 4.3 所示，随着 FFA 处理时间的延长 3T3-L1 脂肪细胞 IL-1β（图 4.3A）、TN图 4.3B）、IL-6（图 4.3C）、MCP-1α（图 4.3D）、MIP-1α（图 4.3E）基因 mRNA达水平较对照组显著增高（P<0.05，差异具有显著性）。沉默 3T3-L1 脂肪细胞 G表达后，FFA 诱导的细胞 TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1α、MIP-1α基因 mRNA 的表

FFA 诱导 3T3-L1 脂肪细胞炎症因子 IL-1β（A）、TN基因 mRNA 表达的影响（* P<0.05，与 Ctrl 组相应时间点数据比较；n=3）

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本文编号：2804528