蛋白质二硫键异构酶A3作为靶抗原在小鼠成年时期AIT及其相关脑损害发病机制中的作用研究

发布时间：2020-08-26 07:56

【摘要】：目的:自身免疫甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)除可致甲状腺破坏外,还可引起其他重要组织器官受累,其中AIT相关脑损害正逐渐受到关注。该病常伴有抗甲状腺过氧化物酶(Thyroid peroxidase antibody,TPOAb)抗体和抗甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody,Tg Ab)增高,但研究发现,甲状腺自身抗体滴度高低与脑病严重程度无相关性,其可能仅是一个自身免疫标志物而非直接致病因素。这一发现提示,甲状腺自身免疫反应本身可能产生了引起中枢神经系统受损的因素,而存在于甲状腺和脑组织的共同抗原所诱发的交叉自身免疫反应累及中枢神经系统被认为是最可能的致病机制。近期文献报道了蛋白质二硫键异构酶A3(Protein disulfide-isomerase A3,PDIA3)能防止脑脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中的β淀粉样蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)沉淀导致的斑块形成,其能够作为一种重要的抗细胞毒性神经保护蛋白。并且PDI在下丘脑-垂体-甲状腺轴中起着重要作用。研究发现抗PDIA3抗体(PDIA3Ab)在一些免疫性疾病中有升高,PDIA3Ab对PDIA3活性有较强的抑制作用,其造成的功能改变可引起甲状腺及中枢神经系统功能异常。除此之外,PDIA3Ab可能通过ADCC、CDC引起组织细胞损伤。目前尚未报道PDIA3是否作为AIT发生、发展过程中共存于甲状腺和脑组织的靶抗原以及抗PDIA3抗体能否介导甲状腺和脑功能的自身免疫性损伤。本研究将对高碘诱导的NOD.H-2h4自发性自身免疫甲状腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT)小鼠模型以及Tg诱导的CBA/J实验性自身免疫甲状腺炎(experiment autoimmune thyroiditis,EAT)小鼠的PDIA3Ab表达水平进行分析,并使用PDIA3重组蛋白诱导CBA/J免疫易感小鼠,对上述的问题进行逐一探讨,为临床防治AIT和AIT相关脑损害提供新思路和新方向。研究方法:选取6周龄NOD.H-2h4雌性小鼠随机分入高碘组和control组。高组饲以含0.05%碘化钠的无菌水构建SAT动物模型。对照组饲以无菌双蒸水。于实验开始后第12周处死小鼠。检测PDIA3Ab及Tg Ab水平。HE染色观察甲状腺炎症细胞浸润程度。8周龄CBA/J雌性小鼠随机分入EAT组和control组,EAT组小鼠先后间隔2周给予小鼠源Tg(murine,m Tg)200μg/只加弗氏佐剂二次免疫,构建EAT动物模型。control组给予等量无菌蒸馏水加弗氏佐剂作为对照。末次免疫后4周处死小鼠。检测血清PDIA3Ab及Tg Ab水平。观察甲状腺炎症细胞浸润程度。确定正常成年小鼠甲状腺和脑组织中PDIA3蛋白的表达以及细胞定位。5周龄CBA/J雌性小鼠随机分入PDIA3组和control组,也如给予m Tg免疫建立EAT的方式,PDIA3组小鼠先后间隔2周给予重组蛋白75μg/只加弗氏佐剂二次免疫。control组给予等量无菌蒸馏水加弗氏佐剂。分别于末次免疫后4周、6周、10周、14周和18周进行相关检测。检测血清PDIA3Ab和Tg Ab水平,评估甲状腺炎症细胞浸润程度。有无Ig G、补体C3、膜攻击复合体MAC的沉积以及Cleaved caspase3检测细胞凋亡。血清检测TT4和TSH评估小鼠的甲状腺功能。RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-4、IL17、以及TGF-βm RNA表达。观察大脑皮层及海马微血管超微结构。Morris水迷宫和长时程增强(LTP)实验评估小鼠学习记忆能力。GFAP的表达情况以及蛋白质组微阵列(Microarray)检测脑组织细胞因子和趋化因子的表达。结果:1.SAT组和EAT组小鼠造模成功,SAT组和EAT组小鼠血清中PDIA3Ab总Ig G水平与control组相比显著升高(P0.05),并且与Tg Ab呈正相关(P0.05)。EAT组小鼠血清中PDIA3Ab总Ig G及亚型Ig G1、Ig G2a水平较control组显著升高(P0.05)。EAT组小鼠血清中存在PDIA3Ab,可特异性识别共存于甲状腺和脑组织中的自身抗原PDIA3。2.正常小鼠甲状腺滤泡上皮细胞、血管内皮细胞以及脑组织中神经元、星型胶质细胞、血管内皮细胞均有PDIA3表达,小胶质细胞未发现PDIA3表达。3.PDIA3重组蛋白免疫后10周起,各时点PDIA3组小鼠血清PDIA3Ab总Ig G及亚型Ig G1、Ig G2a、Ig G2b的水平较control组相比显著升高(P0.05),其高水平状态可持续至末次免疫后18周,亚型升高水平在不同时点以Ig G2a为主。4.RT-PCR检测发现,PDIA3末次免疫后10周IL-4、IL17A以及TGF-βm RNA的表达较control组显著升高(P0.05),PDIA3末次免疫后14、18周IL17A m RNA的表达较control组显著升高(P0.05)。5.免疫后各时点PDIA3组小鼠血清Tg Ab总Ig G的水平较control组均未出现明显差异。PDIA3组与control组甲炎发病率及甲炎评分无显著性差异。6.PDIA3组小鼠甲状腺内的滤泡上皮细胞和血管内皮细胞出现不同程度的补体C3以及膜攻击复合体MAC沉积,滤泡上皮细胞的C3以及MAC沉积于末次免疫后10周起明显高于control组。7.PDIA3组小鼠存在C3沉积的甲状腺组织内可见局部滤泡上皮细胞有Ig G沉积,沉积处的Ig G可能是PDIA3Ab。8.PDIA3组小鼠甲状腺内Cleaved Caspase-3阳性表达较对照组相比显著增多,且末次免疫后14周和18周,PDIA3组小鼠血清中TSH浓度较对照组相比显著升高,统计学差异显著(P0.05)。9.Morris水迷宫实验发现末次免疫后10周起,各时期的PDIA3组小鼠逐渐出现空间学习记忆能力的下降。LTP结果显示,末次免疫后14周,小鼠出现学习记忆能力的下降。10.透射扫描电镜观察发现,末次免疫后10周PDIA3组小鼠皮质及海马中的微血管周围已出现明显的水肿。11.末次免疫后10周起PDIA3组小鼠微血管内皮和血管周围神经元有C3和MAC的沉积,C3沉积部位同时存在Ig G沉积,沉积处的Ig G可能是PDIA3Ab。12.TUNEL试剂盒检测发现末次免疫后10周起PDIA3组小鼠脑组织与control组相比存在明显的细胞凋亡。13.末次免疫后10周control组和PDIA3组脑组织的细胞因子IL-5、IL-6、IL-13、IL-12p70、MIG、MIP-1α有升高趋势,未出现明显差异。结论:1.在SAT和EAT小鼠血清中存在特异性识别PDIA3的自身抗体存在。其Ig G型自身抗体升高的亚型中存在具有较强介导补体依赖的细胞毒性作用(CDC)的亚型(Ig G2a)。2.PDIA3为存在于小鼠正常的甲状腺中的自身抗原。针对PDIA3的自身免疫可通过补体介导的细胞毒性作用损伤小鼠滤泡上皮细胞,损伤甲状腺功能,导致甲状腺的储备功能减退。3.PDIA3为存在于小鼠正常的脑组织中的自身抗原。针对PDIA3的自身免疫反应可通过补体介导的细胞毒性作用损伤大脑皮质和海马的微血管内皮细胞功能,造成血管周围组织水肿。补体C3进入脑组织后,也可作用于神经细胞,造成神经细胞凋亡,最终出现空间学习记忆功能下降的脑功能改变。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R581.4
【图文】：

中国医科大学博士学位论文冰冻切片 HE 染色可见，SAT 组小鼠甲状腺内甲状腺滤泡大小不一并伴有不同程度的扩张和破坏，其间可见明显的炎症细胞浸润（图 1.1A,B）。ELISA 法检测小鼠血清中 TgAb 总 IgG 的水平，结果发现 SAT 组小鼠血清中 TgAb 总 IgG 的水平较 control 组显著升高（图 1.1 C）。上述结果表明已成功建立 SAT 动物模型。ABC

图 1.2 小鼠甲状腺病理组织学检查及血清 TgAb 水平检测A.control 组小鼠甲状腺组织 HE 染色所见（×200）。B.EAT 组小鼠甲状腺组织 HE 染所见（×200）。C.EAT 组及 control 组鼠血清 TgAb 总 IgG 水平检测，血清稀释比为 1:100EAT 组（n=20）及 control 组（n=16）比较：***P＜0.001。3.2 小鼠血清 PDIA3 总 IgG 及亚型表达的检测结果3.2.1 SAT 组小鼠血清 PDIA3 总 IgG 检测结果利用间接 ELISA 法分析比较 SAT 组及 control 组鼠血清中 PDIA3 总 IgG水平，结果显示：SAT 组鼠血清中 PDIA3 总 IgG 水平显著高于 control 组（图A），并且与 TgAb 呈正相关（图 1.3 B）。AB

图 1.2 小鼠甲状腺病理组织学检查及血清 TgAb 水平检测A.control 组小鼠甲状腺组织 HE 染色所见（×200）。B.EAT 组小鼠甲状腺组织 HE 染色所见（×200）。C.EAT 组及 control 组鼠血清 TgAb 总 IgG 水平检测，血清稀释比为 1:1000；EAT 组（n=20）及 control 组（n=16）比较：***P＜0.001。3.2 小鼠血清 PDIA3 总 IgG 及亚型表达的检测结果3.2.1 SAT 组小鼠血清 PDIA3 总 IgG 检测结果利用间接 ELISA 法分析比较 SAT 组及 control 组鼠血清中 PDIA3 总 IgG 的水平，结果显示：SAT 组鼠血清中 PDIA3 总 IgG 水平显著高于 control 组（图 1.3A），并且与 TgAb 呈正相关（图 1.3 B）。AB

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本文编号：2804914