miR-196b-5p调节脂肪细胞分化和脂合成的作用及机制研究

发布时间：2020-09-05 07:36

　　目的microRNA是一类进化上保守的小分子非编码RNA,在转录后水平发挥调控作用。有研究报道microRNA在间充质干细胞成脂分化方面发挥作用,但在脂质合成和脂质分解方面的作用及相关的分子机制却还有待探索。本研究在体外水平探讨了miR-196b-5p在成脂分化、脂质合成和脂质分解中的功能及其作用机制。方法1.在骨髓基质细胞系ST2及间充质干细胞系C3H10T1/2中,运用实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测miR-196b-5p在转染miR-196b-5p mimics后的变化。在两个细胞系中升高或降低miR-196b-5p水平,成脂诱导分化后用油红O染色、甘油三酯(triglyceride,TG)测定、qRT-PCR及Western blotting等技术手段检测miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2成脂分化和脂合成过程中的作用。2.利用Targetscan靶基因预测软件及双荧光素酶酶活检测技术确定了miR-196b-5p的靶基因,并通过Western blotting技术探究miR-196b-5p与靶基因有关信号通路的调控关系;利用功能获得性实验和功能缺失性实验探究miR-196b-5p靶基因在脂肪细胞分化和脂合成中的作用;利用Rescue进一步确定miR-196b-5p与靶基因有关信号通路之间的调控关系。结果1.向ST2和C3H10T1/2细胞系转入体外miR-196b-5p模拟物mimics后,细胞内miR-196b-5p水平显著增加。利用miR-196b-5p mimics升高miR-196b-5p水平后,明显促进细胞成脂分化,TG水平上升,脂肪细胞分化关键因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、CCATT增强子结合蛋白α(CCATT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein,aP2)和脂联素(adiponectin,Adipoq)显著增加,脂质合成关键因子硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,Scd1)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,Fasn)、甾醇调节元件结合蛋白同种型c(sterol regulatory element-binding protein 1 isoform c,Srebp1c)和乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1,Acc1)、脂滴包被蛋白(perilipin)以及脂质分解特征性因子过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1(peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1,Acox1)、脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,Atgl)和脂蛋白脂肪酶(lipoprteinlipase,Lpl)的表达量均上调。反之,利用miR-196b-5p inhibitor抑制miR-196b-5p后,则明显抑制细胞成脂分化及上述基因的表达。2.利用Targetscan生物信息学软件预测了miR-196b-5p潜在靶基因为结节性硬化症复合物1(tuberous sclerosis complex 1,Tsc1)和哺乳动物雷帕霉素靶点的雷帕霉素不敏感的伴侣(rapamycin-insensitive companion of mammalian target of rapamycin,Rictor);成功构建包含miR-196b-5p结合序列的Tsc1和Rictor 3’UTR的重组基因载体,并通过双荧光素酶酶活检测证明了miR-196b-5p能够与Tsc1 3’UTR结合而降低荧光素酶表达活性,结合位点突变后荧光素酶酶活性增加;miR-196b-5p能够抑制Tsc1蛋白表达水平,以上均证明Tsc1为miR-196b-5p靶基因。转染miR-196b-5p的ST2细胞经成脂诱导分化后,哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)、S6激酶β-1(S6 kinase beta-1,S6K1)、核糖体蛋白S6(Ribosomal protein S6,RPS6)和4E结合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)磷酸化蛋白水平升高,证明miR-196b-5p能够激活哺乳动物雷帕霉素靶点复合物1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)信号通路。构建Tsc1过表达质粒进行功能获得性实验,合成siRNA进行功能缺失性实验;靶基因功能实验表明,过表达Tsc1能够抑制ST2细胞成脂分化,脂质合成及分解因子也显著下调,而抑制内源性Tsc1表达则显著促进ST2细胞成脂分化,相关因子显著上调。Rapamycin抑制mTORC1信号通路后,能够拯救被miR-196b-5p促进的成脂分化水平。结论1.miR-196b-5p mimics能显著增加miR-196b-5p在ST2和C3H10T1/2细胞中的水平。miR-196b-5p mimics可以促进细胞成脂分化、脂质合成和脂质分解;反之miR-196b-5p inhibitor则抑制细胞成脂分化、脂质合成和脂质分解。2.Tsc1是miR-196b-5p的靶基因。3.miR-196b-5p过表达可以激活mTORC1信号通路。4.Tsc1过表达能够抑制ST2细胞向脂肪细胞分化,脂质合成和脂质分解相关因子明显下调;Tsc1被抑制后细胞成脂分化被促进,脂质合成和脂质分解相关因子显著上调。5.通过抑制剂Rapamycin,验证了miR-196b-5p通过mTORC1信号通路调控成脂分化。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

转染,细胞系,硕士学位论文

天津医科大学硕士学位论文结果1 转染后 ST2 和 C3H10T1/2 细胞系中 miR-196b-5p 水平的检测为了检测 miR-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 细胞系中是否-196b-5p 水平，我们将 miR-196b-5p mimics 及其阴性对照 NC mimics ST2 和 C3H10T1/2 细胞，待细胞汇合度达到 100%时测定 miR-196b-的水平变化。结果显示，转染 miR-196b-5p mimics 后，ST2 细-196b-5p 成熟体的水平为阴性对照组的 76 倍（图 1.1 A）；C3H10T1/2miR-196b-5p 成熟体的水平为阴性对照组的 80.29 倍（图 1.1 B），-196b-5p mimics 在 ST2 和 C3H10T1/2 细胞中能够有效增加 miR-196b

转染,特异性基因,水平表,灰度

图 1.2 miR-196b-5p mimics 对 ST2 成脂分化的影响（200×）* 与 Control 相比，P < 0.05成脂诱导3 d后qRT-PCR和Western blotting检测成脂相关特异性基因表达qRT-PCR 结果显示与阴性对照组相比，转染 miR-196b-5p mimics 组中 PPARγC/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表达量均上调（图 1.3 A），其表达量分别是阴性对照组的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westerblotting 结果显示与阴性对照组相比，转染 miR-196b-5p mimics 组中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表达量均上调（图 1.3 B），其蛋白灰度分别是阴性对照组的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（图 1.3 C）。

特异性因子,蛋白表达,转染,特异性基因

图 1.2 miR-196b-5p mimics 对 ST2 成脂分化的影响（200×）* 与 Control 相比，P < 0.05成脂诱导3 d后qRT-PCR和Western blotting检测成脂相关特异性基因表达。qRT-PCR 结果显示与阴性对照组相比，转染 miR-196b-5p mimics 组中 PPARγ、C/EBP 、aP2、Adipsin 和 Adipoq mRNA 水平表达量均上调（图 1.3 A），其表达量分别是阴性对照组的 2.80 倍、2.27 倍、4.01 倍、3.59 倍和 7.36 倍；Westernblotting 结果显示与阴性对照组相比，转染 miR-196b-5p mimics 组中 PPARγ、C/EBP 、aP2 蛋白的表达量均上调（图 1.3 B），其蛋白灰度分别是阴性对照组的 2.18 倍、11.05 倍和 2.27 倍（图 1.3 C）。

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