46,XY性发育异常的基因突变研究及NR5A1基因罕见变异的体外功能验证

发布时间：2020-09-07 18:24

　　背景46,XY性发育异常(disorders of sex development,DSD)患者主要以外生殖器男性化不足为特征,可有性腺发育异常,伴或不伴苗勒氏管结构。其遗传背景复杂,目前已发现30余个相关致病基因,由于不同基因突变患者临床表型缺乏特异性,准确的诊断依赖基因测序技术。传统的一代测序通量低,测序成本高,对46,XYDSD患者突变基因检出率不超过20%。因此,选用适当的基因测序方法来提高该类患者基因检出率具有重要意义。NR51(nuclear receptor subfamily 5 group A member 1)基因突变是46,XYDSD较为常见的病因,其发生率约为10-20%。NR5A1是一种关键的转录因子,调控多种类固醇激素合成及性发育相关基因的表达,对下丘脑-垂体-肾上腺及性腺的发育有重要作用。研究NR5A1基因突变患者临床特征及突变位点的致病性,有助于提高对该类疾病及NR5A1蛋白重要功能位点的认识。目的本研究将对46,XY DSD患者进行致病基因突变的筛查,以明确该类患者致病基因的分布及其发生率;分析NR5A1基因突变患者临床表型,同时对NR5A1突变蛋白进行体外功能实验,验证其致病性。方法2016年11月至2018年4月,在北京协和医院内分泌科性腺门诊招募46,XY性发育异常患者,收集患者的一般临床资料。采集外周血提取白细胞DNA。设计与性发育相关的基因外显子区域的特异性的捕获探针。采用目标基因外显子捕获,联合二代测序的方法,筛选患者的致病基因。进一步用Sanger测序方法验证变异位点。利用双荧光素酶报告系统及微基因报告系统进行细胞实验,分别验证突变型NR5A1对其靶基因CYP11A1转录调节功能的影响及突变对NR5A1基因RNA剪接的影响。结果(1)本研究共纳入46,XYDSD患者18例,其中10例患者检测到46,XY DSD相关基因突变,基因突变检出率为56%。AR基因和SRD5A2基因突变患者各3例,突变发生率为16.7%,NR5A1、LHCGR、CYP17A1、MAP3K1基因突变各检出1例,发生率为5.6%。(2)在前期研究基础上,纳入12例检测到NR5A1基因罕见变异的46,XYDSD患者,所有患者均表现为性发育异常,不存在肾上腺皮质功能减退的症状。其中2例患者为男性社会性别,10例患者为女性社会性别。体格检查显示5例患者外生殖器表现为完全女性外阴,3例患者表现为阴蒂肥大,3例患者为外生殖器难辨,1例患者表现为尿道下裂。所有患者性腺为睾丸,45%的患者存在苗勒氏管结构。激素检查显示,除3例患者处于青春发育前期及1例患者处于微小青春期外,其余患者均存在促性腺激素水平升高,2例患者血睾酮水平处于正常范围。(3)41.7%(5/12例)的NR5A1基因突变为己知致病突变,包括p.Ser32Asn,p.Gly35Asp,p.Asn44del,p.Arg84Cys 及 p.Leu233_Glu234insLeuGlnLeu。58.3%(7/12例)的罕见变异未见数据库报道,包括p.Ser21Phe,p.Lys45Glu,p.Ala82Ser,p.Arg89Ser,p.Gly91Asp,p.Arg255Profs*44 和 p.Gln362Serfs*20。体外双荧光素酶报告系统结果显示4例罕见错义变异仅Gly91 Asp突变使NR5A1转录活性降低为野生型的39%;Ser21Phe突变体转录活性为野生型的76%,Ala82Ser和Arg89Ser突变体转录活性与野生型无差异。微基因报告系统结果显示c.244GA(Ala82Ser)导致NR5A1基因2号外显子剪接异常,出现3'末端19个碱基或整个2号外显子缺失的剪接体。结论目的基因外显子捕获联合二代测序是对46,XY DSD患者进行基因突变筛查的有效方法,其突变检出率约为56%。在本研究队列中,AR和SRD5A2基因突变较为常见,约占46,XY DSD患者一半以上。NR5A1基因突变患者主要表现为性发育异常,未见肾上腺功能减退。分别有1个罕见变异影响NR5A1对CYP11A1的转录活性或NR5A1基因的RNA剪接,提示有必要通过功能实验验证罕见变异对蛋白质功能的影响,从而准确评估罕见变异的致病性。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R588
【部分图文】：

剪接位点,顺式作用元件,增强子,外显子

内含子和外显子会一同被转录，形成前ｍＲＮＡ。前ｍＲＮＡ在翻译为蛋白逡逑质前，需经过剪接加工，除去内含子序列，并连接剩余的外显子序列而形成成熟的逡逑ｍＲＮＡＷ３（）Ｕ图１－１）。这一剪接反应发生在细胞核中，受多种顺式作用元件和反式作逡逑用因子的相互作用调节［３１］。逡逑５＇邋ｓｓ逦３＊邋ｓｓ逡逑＿逦｜逦Ｉｎｔｒｏｎ邋Ｂｒａｎｃｈ邋＝逦（逦｜逡逑一…．…淦………－逦：逦羞一．．．．．一ｊ逦ＩＳＥ逦ＩＳＳ邋ｐｏｉｎｔ逦，二二二■．邋ｊ—逡逑ＥＳＥ逦ＥＳＳ逦＊逦ＥＳＥ逦ＥＳＳ逡逑？逡逑ｔ逡逑Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ病、逡逑ｉｉ｜（｜ｏｔｅｉｎ｜逦ｇｓ｜0ｉｅ？ｒ．＊逡逑Ｅｘｏｒｎ邋＾Ｅｘｏｎ２逦｜３．逡逑ＥＳＥ逦ＥＳＳ邋＾逦ＥＳＥ逦ＥＳＳ逡逑＃邋Ｉｎｔｒｏｎ邋ｊｒ逦ｍ逡逑５－邋．邋Ｉ逦Ｅｘｏｎｌ邋｜逦ｊ邋＾＿＿：逦—２邋｜逦｜邋３－逡逑＊逦ＥＳＥ逦ＥＳＳ逦ＥＳＥ逦ＥＳＳ逡逑图１－］：真核生物基因剪接过程逡逑顺式作用元件包括５＇剪接位点，３＇剪接位点，外显子剪接增强子（ＥＳＥ）和外显逡逑子剪接沉默子（ＥＳＳ），内含子剪接增强子（ＩＳＥ）和内含子剪接沉默子（ＩＳＳ）。反逡逑式作用因子包含剪接体，不均一核糖核蛋白（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ邋Ｎｕｃｌｅａｒ逡逑Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｈｎＲＮＰ）和丝氨酸－精氨酸蛋白（ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＲ）等逡逑［３１］。剪接体由５个小的核糖核蛋白复合体（ｓｎＲＮＰｓ：邋Ｕｌ，Ｕ２，邋Ｕ４，Ｕ５和Ｕ６）以逡逑及１５０种以上蛋白质组成

测序,患者,基因变异,临床意义

其中他基因变异患者３例（３／１８例，１６．６％），双／乃７２基因变异患者３逡逑例（３／１８邋例，１６．６°／。），尤７邋基因突变各检出邋１邋例逡逑（１／１８例，５．６％）（图３－１）。详细变异位点信息见表３－３。其中５０％邋（５／１０个）为错逡逑义突变，２０％邋（２／１０个）为剪接位点突变，缺失突变、无义突变及同义突变的发生逡逑率均为１０％邋（１／１０个）。５０％邋（５／１０个）的突变位点为已知致病突变，５０％邋（５／１０逡逑个）突变位点为临床意义未明的罕见变异。逡逑＇ｆｔ邋＿逡逑图３－丨：４６，ＸＹ邋ＤＳＤ患者二代测序结果逡逑表３－３：邋４６，ＸＹ邋ＤＳＤ患者二代测序检出罕见基因变异位点结果逡逑编号邋基因邋Ｃ．ＤＮＡ改变逦氨基酸改变逦ＳＮＰ邋（ＭＡＦ）逦临床意义逡逑ＤＳＤ－Ｙ０１逦ＡＲ逦ｃ．邋２６０８Ａ＞Ｔ逦ｐ．ｌｌｅ８７０Ｐｈｅ逦半合逡逑ＤＳＤ－Ｙ０７逦ＡＲ逦ｃ．２０７１＿２０７３ｄｅｌ逦ｐ．６９１ｄｅｌ逦半合逦已知致病突变［３９］逡逑ＤＳＤ－Ｙ０９逦ＡＲ逦ｃ．邋１８４７Ｇ＞Ａ逦ｐ．Ａｒｇ６１６Ｈ

基因突变,位点,氨基酸,爪蛙

基因突变位点氨基酸８７０Ｉｌｅ、基因突变位点氨基酸２１０Ｐｒｏ及逡逑Ｚ／ＺＣＧｉ？基因突变位点氨基酸３３０Ａｓｐ在人、小鼠、大鼠、猕猴、猩猩、猪、狗、牛、逡逑兔、猫、爪蛙、斑马鱼等不同物种中高度保守（图３－３）。逡逑３７逡逑

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