长链非编码RNA与类风湿关节炎相关性的分子流行病学研究

发布时间：2020-09-07 16:19

　　研究背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、常见的自身免疫性疾病,其主要病变特点为关节炎症、滑膜炎、关节软骨损坏,并且伴有机体内多个系统的炎症和免疫反应。RA可以导致关节疼痛、侵蚀、畸变,最终造成患者关节功能的丧失,具有很高的致残率。RA发病机制比较复杂,至今尚未阐明,研究发现一些机体因素(比如遗传易感性、异常免疫反应、代谢酶异常)和环境因素(比如细菌、病毒感染)等均参与RA的发病过程。近年来,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)在疾病发展中的作用逐渐受到人们的关注,研究表明ncRNA涉及到多种疾病的发病机制。其中,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指一类长度超过200个核苷酸、且不具有翻译蛋白质功能的RNA。LncRNA可以通过多种机制发挥不同的生物学功能,参与染色质重塑、选择性剪接、蛋白质转运等生物学过程,能够从表观遗传学、转录水平、转录后水平以及蛋白质代谢等多个方面调节基因表达。研究显示,lncRNA参与调节了体内与自身免疫、炎症相关的反应过程,包括核转录因子-κB信号通路、Toll样受体信号通路、细胞因子分泌、免疫细胞增殖和分化等。多种lncRNA已经被证实,在RA发病机制中发挥着重要的作用,其异常表达与疾病进程密切相关。通过全基因组关联研究(genome-wide association studies,GWAS)发现了大量与RA等疾病易感性相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)位点,其中大部分位于基因非编码区。然而,目前关于lncRNA基因变异在RA发病中作用的研究较少,因此,本研究拟从基因变异与表达方面对lncRNA与RA的相关性进行探讨。目的探索四种lncRNA(ANRIL、lnc-DC、MALAT1、ZFAS1)基因多态性与RA遗传易感性的关联。分析这四种lncRNA在RA患者和健康对照外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中表达水平的差异,并探讨其表达水平与RA患者主要实验室指标、疾病活动度之间的关联。方法本研究采用病例-对照设计,分为以下三个部分:(1)LncRNA基因多态性与RA易感性的关联研究本研究共选取了1370名研究对象进行基因分型实验,其中包括660例RA患者和710例健康对照。RA患者均来自于安徽医科大学第一附属医院、安徽省立医院风湿免疫科的门诊或住院患者,其诊断标准均符合1987年美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)修订的RA分类标准。健康对照是来源于安徽医科大学第一附属医院和第二附属医院健康体检中心。本研究纳入的RA患者和健康对照均为相互间无血缘关系的中国汉族人。利用多重高温连接酶检测反应(improved multiple ligase detection reaction,iMLDR)技术对ANRIL基因6个SNP位点(rs1412830、rs7044859、rs944796、rs61271866、rs2518723、rs3217992)、lnc-DC基因2个SNP位点(rs7217280、rs10515177)、MALAT1基因5个SNP位点(rs619586、rs4102217、rs591291、rs11227209、rs35138901)以及ZFAS1基因4个SNP位点(rs237742、rs73116127、rs6125607、rs6125608)进行分型检测。对上述位点在RA患者和健康对照中的等位基因、基因型、显性模型以及隐性模型的频率分布情况进行分析,并分析上述位点多态性与RA患者抗环瓜氨酸肽抗体(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)、类风湿因子(rheumatoid factor,RF)之间的关系。最后,利用SHEsis软件构建各lncRNA基因的单倍型,分析其在RA患者、健康对照的分布差异。(2)RA患者和健康对照PBMC中lncRNA表达情况本研究共收集120例RA患者和120例健康对照,利用定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测RA患者和健康对照PBMC中lncRNA(ANRIL、lnc-DC、MALAT1、ZFAS1)的表达水平,并分析两组研究对象之间的表达差异。然后,将RA患者分为ACPA阳性RA患者和ACPA阴性RA患者、RF阳性RA患者和RF阴性RA患者,进一步分析ACPA阳性与ACPA阴性RA患者之间、RF阳性与RF阴性RA患者之间lncRNA表达水平的差异。最后,探讨RA患者lncRNA表达水平与其它实验室指标C3、C4、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)以及疾病活动度之间的相关性。(3)RA患者中lncRNA基因多态性与其表达水平间的关联本研究中有65例RA患者同时进行了基因分型和qRT-PCR实验。在这些患者中,我们对lncRNA基因SNP位点不同基因型之间相应lncRNA的表达水平进行了比较,初步探讨RA患者中lncRNA基因多态性对其表达水平的影响。在基因分型实验中,利用哈德-温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)定律检验所有SNP位点在健康对照中的基因型分布是否满足遗传平衡定律。采用Logistic回归分析计算各SNP位点的统计学关联强度(odds ratio,OR)及95%可信区间(confidence interval,CI),并进行性别、年龄校正。在qRT-PCR实验中,采用β-actin标化lncRNA的表达含量,使用2~(-△△Ct)来表示各lncRNA的相对表达水平。采用Epi Data 3.1软件建立数据库,采用SPSS 23.0软件进行数据分析,采用GraphPad Prism version 5.0软件绘制散点图。所有统计学分析均是双侧检验,检验水准α=0.05,但在基因型频率的统计分析中需要对进行检验水准校正,校正后α=0.003(0.05/16)。结果(1)LncRNA基因多态性与RA易感性的关联研究经过HWE平衡定律检验发现,rs7044859位点在健康对照中的基因型分布不符合HWE遗传平衡,因此,该位点未纳入本研究的最终分析中。结果发现ANRIL基因5个SNP位点(rs1412830、rs944796、rs61271866、rs2518723、rs3217992)、lnc-DC基因2个SNP位点(rs7217280、rs10515177)、MALAT1基因5个SNP位点(rs619586、rs4102217、rs591291、rs11227209、rs35138901)以及ZFAS1基因4个SNP位点(rs237742、rs73116127、rs6125607、rs6125608)的基因型以及等位基因频率在RA患者和健康对照之间的分布差异均无统计学意义(均有P0.003)。本研究同时对上述位点在显性模型、隐性模型下与RA遗传易感性的关联进行了分析,结果显示均不存在统计学意义的关联(均有P0.003)。对lncRNA基因多态性与RA患者ACPA、RF之间的关联分析发现,ACPA阳性RA患者中rs944796位点G等位基因、rs2518723位点T等位基因频率均高于ACPA阴性RA患者(均有P0.05),而rs3217992位点T等位基因频率低于ACPA阴性RA患者(P=0.039)。本研究未发现lncRNA基因SNP位点基因型、等位基因频率与RA患者RF之间存在统计学联系(均有P0.05)。本研究利用SHEsis软件,分别构建出ANRIL基因上的6种常见单倍型(CCATC、CCTCC、CCTCT、CCTTC、CGTTC、TCATC)、lnc-DC基因上的3种常见单倍型(AG、GA、GG)、MALAT1基因上的6种常见单倍型(ACTCT、AGCCT、AGTCC、AGTCT、GGTCT、GGTGT)以及ZFAS1基因上的5种常见单倍型(CACA、CGCA、CGCG、CGTA、TGCA)。结果发现,ZFAS1基因的CGTA单倍型在RA患者的频率明显高于健康对照(P=0.036,OR=1.191,95%CI:1.012-1.402),而其它lncRNA基因的单倍型在RA患者和健康之间的频率分布差异均无统计学意义(均有P0.05)。(2)RA患者和健康对照PBMC中lncRNA表达情况RA患者PMBC中ANRIL、lnc-DC、MALAT1、ZFAS1的表达水平均明显低于健康对照,差异均有统计学意义(Z=-5.244,P0.001;Z=-8.169,P0.001;Z=-10.138,P0.001;Z=-7.650,P0.001)。ACPA阳性与ACPA阴性RA患者之间的这四种lncRNA表达水平差异均无统计学意义(均有P0.05),而RF阳性与RF阴性RA患者之间这四种lncRNA的表达水平差异也均无统计学意义(均有P0.05)。对RA患者lncRNA表达水平与其他实验室指标之间的相关性分析发现,RA患者PBMC中ZFAS1的表达水平与其CRP含量呈负相关(r_s=-0.278,P=0.002);lncRNA表达水平与RA患者C3、C4、ESR水平之间的相关性均无统计学意义(均有P0.05)。本研究采用DAS28来评估RA患者疾病活动情况,结果未发现这四种lncRNA表达水平与RA患者DAS28评分之间存在统计学意义的相关性(均有P0.05)。最后,本研究探讨了RA患者临床用药情况对其lncRNA表达水平的影响,结果发现糖皮质激素、改善病情抗风湿药物以及生物制剂等对RA患者PBMC中lncRNA表达水平均无影响。(3)RA患者中lncRNA基因多态性与其表达水平间的关联MALAT1基因rs4102217的显性模型(GG vs.CG+CC)与MALAT1的表达水平之间关联具有统计学意义(P=0.019),携带rs4102217 GG基因型的RA患者PBMC中的MALAT1表达水平降低。而其它lncRNA基因多态性与其表达水平之间均无统计学意义的关联(均有P0.05)。结论(1)ANRIL基因上5个SNP位点、lnc-DC基因上2个SNP位点、MALAT1基因上5个SNP位点、ZFAS1基因上4个SNP位点多态性与RA遗传易感性之间无统计学关联;但ANRIL基因rs944796、rs2518723、rs3217992位点多态性与RA患者ACPA之间存在关联。(2)与健康对照相比,RA患者PBMC中ANRIL、lnc-DC、MALAT1以及ZFAS1的表达水平均明显降低,而且ZFAS1的表达水平与RA患者CRP含量呈负相关;(3)RA患者PBMC中MALAT1表达水平受到rs4102217位点多态性影响。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

扩增曲线

ANRILqRT-PCR扩增曲线图

扩增曲线

Lnc-DCqRT-PCR扩增曲线图

扩增曲线

图 4 MALAT1 qRT-PCR 扩增曲线图Fig 4 Amplification curve diagram of MALAT1 by qRT-PCR

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