基于iTRAQ技术的脱氢表雄酮（DHEA）促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化机制研究

发布时间：2020-09-09 19:03

　　研究背景伴随人口老龄化,骨质疏松发病率有逐年增高趋势。老龄化引起骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降与骨质疏松发病存在密切关系。目前普遍认为,骨质疏松的病理生理学基础在于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收功能失衡。因此,对于骨质疏松的治疗主要以药物为主,临床上常用的骨吸收抑制剂主要包括双膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂、降钙素以及雌激素。尽管各类抗骨质疏松药物在临床治疗中取得了一定的疗效,但目前对于骨质疏松的治疗仍然未有明确的靶点,无明确的机制以及精准的治疗。老年性雌激素缺乏的骨质疏松患者可以通过口服DHEA来治疗,临床已经表明DHEA能够改善骨质疏松症状,促进骨密度增加。DHEA主要由肾上腺分泌,同时也由性腺和大脑分泌,可在在外周组织通过转化雄激素或雌激素发挥作用,然而目前为止,对DHEA促进间充质干细胞成骨分化能力的蛋白质分子的基础研究,未见报道。而各类含DHEA抗骨质疏松的药物在临床治疗仍然未有明确的靶点,未曾有明确的机制以及精准的治疗。本项目拟采用hMSCs成骨诱导体系±DHEA,采集不同时间点的药物处理组与对照组蛋白,首先证实DHEA对骨髓间充质干细胞成骨分化能力测定以及对相关基因表达情况的分析,再运用定量蛋白质组学技术创建药物处理组和对照组的差异蛋白表达谱,通过对差异性蛋白质分子进行相关细胞成分及可能涉及的信号通路分析,选择潜在分子标志物为目标,运用RT-PCR及Western-Blotting对筛选出的重要差异分子进行验证,分析该分子在DHEA促进间充质干细胞成骨分化过程中的作用,为进一步探索该蛋白在提高干细胞成骨分化能力潜在的应用价值提供理论依据和实验基础。研究目的DHEA与骨髓间充质干细胞成骨分化能力存在密切关系,通过研究DHEA促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程,对比DHEA、成骨诱导体系以及DHEA存在成骨诱导体系中对干细胞成骨分化能力的影响,并深入研究此过程中蛋白质种类、数量有何改变,是否存在特征性差异蛋白在整个MSCs向成骨细胞分化的过程中表达逐渐增高或降低,可作为促进MSCs成骨分化的药物治疗靶标,且特征性差异蛋白分子的作用机制以及与MSCs成骨分化的关系,为DHEA临床治疗骨质疏松提供临床依据。研究方法(1)人骨髓间充质干细胞的提取及药物处理:提取健康成年人骨髓间充质干细胞,并培养至第三代,以DHEA±成骨诱导体系诱导BMSCs定向成骨细胞分化,于4、7、14天测定成骨细胞ALP活性及相关成骨基因(Alp\Oop\Bmp2\Runx2\Col1a1\Smad1)的表达检测,并行碱性磷酸酶、茜素红染色,观察成骨分化程度。(2)质谱分析测定相关差异蛋白的种类及数量:提取各组总蛋白,测定蛋白浓度,还原烷基化处理,然后蛋白酶解,采用TMT试剂对全部肽段进行标记,然后进行串联质谱分析,筛选DHEA促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的差异蛋白。差异蛋白的表达验证:应用RT-PCR技术对不同时间点各组DHEA促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中差异蛋白CHAD在mRNA水平的表达进行验证。应用Western-Blotting技术对不同时间点各组DHEA促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中差异蛋白在蛋白水平的表达进行验证。研究结果(1)考察各组对骨髓间充质干细胞成骨分化的能力:各分组中,DHEA+成骨诱导体系对促进间充质干细胞成骨分化作用最明显,表现在成骨细胞碱性磷酸酶活性检测上效果最优,成骨诱导组次之,单纯药物组性能最低。茜素红染色及碱性磷酸酶染色均表现为各分组中DHEA+成骨诱导体系组诱导效果最优;RT-PCR检测相关成骨基因中,较空白对照组,其他各组均有成骨基因上调,其中DHEA+诱导组上调更明显,相比之下,单纯诱导液组及单纯药物组效果次之。(2)质谱分析:在2次重复的实验中,第一次质谱鉴定到了290495个二级谱图数目,使用赛默飞蛋白质组学比对软件,可从从数据库中匹配到相应的123950个肽段谱图,对应到了59073个肽段的总数,经过总数的肽段再次与数据库比对,得出鉴定到的唯一肽段共有45808个,最总鉴定到的蛋白是根据唯一肽段在数据库中比对而得来,共得到蛋白综述6649个。第二次质谱鉴定结果,鉴定到了294253个数目的谱图数,经赛默飞蛋白组学发掘软件2.1版本从数据库中比对到的肽段谱图数为127343个,与之相对应了59125个肽段,将所有的肽段精确比对,可以得出45975个唯一肽段,最终可以从数据库中匹配到6699个蛋白质。我们将蛋白组学中差异蛋白的最低表达差异倍数超过1.2倍,并且经统计学最小显著差异法筛选出与空白组有统计学意义(统计后P值小于0.05)的筛选标准确定为有意义的差异蛋白质。统计结果如下:在脱氢表雄酮干预的干细胞成骨分化组中,与空白组相比,符合条件的差异蛋白在4天组中总数为566个,其中有341个为上调的蛋白,有225个为下调的蛋白;7天组中相应的总蛋白为587个,其中上调了321个,表达下降的差异蛋白数目为266个;14天组有变化的总蛋白数目为459个,其中上调1.2倍以上的蛋白数目为281个,下降倍数达到1.2倍的差异蛋白数目为178个。其中诱导体系处理组中,4天组表达差异的蛋白总数为606个,其中上调及下调1.2倍以上的蛋白分别为362个以及244个;7天处理组724个差异蛋白中包含了405个上调的蛋白以及319个下调的蛋白;14天组的总蛋白为524个,其中显著上调的数目为302个,显著下调的数目为222个。脱氢表雄酮在成骨诱导体系中对干细胞成骨分化组诱导组中,4天组改变的总蛋白数目为712个,其中上调1.2倍以上为407个,下调的数目为305;7天组中共有666个,其中显著上调为369个,下调297个蛋白;14天组中变化的蛋白数目为547个,显著上调了317个,显著下调了230个。将质朴分析得出的蛋白中,我们根据蛋白功能分类进行了分析,主要是通过GO注释,以及GO功能注释后差异蛋白参与的功能的富集分析,以及差异蛋白所富集在的信号通路做图分析,根据主要富集的信号通路功能来确定感兴趣的蛋白以及信号通路进行下一步分析。相应的注释分析以及富集分析均经过费舍尔检验来评价。我们将个分组中持续上调的差异蛋白进行筛选,通过比对数据库,功能注释以及富集的通路及功能分析,筛选出有潜力的蛋白富含亮氨酸软骨蛋白(Chondroadherin CHAD)作为下一步研究的特征性蛋白。并对各组中特征性蛋白CHAD行RT-PCR验证,CHAD在DHEA+诱导组中在同一时间分组中表达量最高,且在第14天表达量最高,与质谱中蛋白含量升高倍数一致。研究结论DHEA成骨诱导体系比其他组更明显促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,并上调成骨相关基因;筛选出可能调控DHEA诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的相关蛋白分子富含亮氨酸软骨蛋白(Chondroadherin CHAD),并在基因水平验证了其存在。根据KEGG及GO分析,其机制可能是CHAD/JAK/STAT信号通路的激活,并激活下游关键基因干扰素调节因子9(IRF9)的表达,最终使DHEA表达促进间充质干细胞成骨分化的效果,从而参与到诱导成骨形成的过程。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：

干细胞,筛选实验,最适浓度,药物浓度

图 1-1 药物浓度筛选实验（MTT 法）：体外检测干细胞使用含不同浓度的 DHEA 培养基培养示同一时间点不同浓度检测细胞对药物最适浓度的筛选结果。Fig 1-1 Drug concentration screening test (MTT method): In vitro detection of stem cells usingdifferent concentrations of DHEA medium culture, showing the same time point of differentconcentrations of cells to detect the optimal concentration of drug screening results3.2 茜素红染色观察茜素红 S 是橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和1%水溶液 pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得一种蒽醌(Anthraquinone)类的衍生物，是茜素磺酸钠盐。茜素红可成骨细胞中的钙盐鳌和成红色物，因干细胞没有成骨细胞所特有的成分，因此用茜素红染色可以评价干细胞是否成骨分化。通过判断

结晶,成骨细胞分化,四唑,磷酸根离子

图 1-2 DHEA 组、诱导组及 DHEA+诱导组 4 天、7 天、14 天的茜素红染色(200×)Fig 1-2 Adenosine red staining of DHEA group, induction group and DHEA+ induction group at da4, 7 and 14 (200×)3.3 碱性磷酸酶染色观察及细胞内碱性磷酸酶活性检测碱性磷酸酯酶是一类成骨细胞分泌，可视为干细胞成功向成骨细胞分化的标志，利用蛋白酶裂解液将细胞裂解后，细胞内的酶释放出来后可高效的针对单酯磷酸并将磷酸基水解，水解磷酸基团后生成磷酸根离子，并在碱性条件下最为有效。该酶是一组同功酶的统称。经过碱性磷酸酯酶的催化可将 BCIP 水解出来的反应物继续于 NBT 反应，生成的四唑硝基蓝是一种不溶性的，呈蓝紫色的结晶。根据结晶颜色可判断爬片

脱氢表雄酮,成骨细胞分化,骨髓间充质干细胞,机制研究

RAQ 技术的脱氢表雄酮(DHEA)促进骨髓间充质干细胞成骨细胞分化机制研究 2015 级硕士学位论文、诱导组及 DHEA+诱导组在第 4 天的时候并未出现明显的蓝色或者蓝色的沉淀，而第 7 天时候除空白组均有 ALP 染色出现，其中 DHEA+诱组染色程度在同一时间点明显高于其他两组，且在第 14 天中更为明。细胞内 ALP 活性水平如图所示，随着培养天数增加，ALP 的活性均加，其中 DHEA+诱导组活性最高，诱导组次之，其中在第 14 天时候组均呈现出较高的表达。

【参考文献】