抑制NF-κb通路可以逆转AngⅡ诱导的β细胞去分化

发布时间：2020-09-15 19:59

　　研究背景糖尿病(diabetes mellitus,DM)已成为21世纪严重危害人类健康的疾病,根据2017年国际糖尿病联合会发布的第八版糖尿病地图数据显示,全球约4.25亿成人患糖尿病,而我国糖尿病患者已达到1.198亿。胰岛β细胞衰竭是2型糖尿病发生发展的中心环节。这种衰竭通常是β细胞的凋亡和功能障碍引起的。现提出,β细胞身份受损可能是胰岛β衰竭另一重要病因。成熟β细胞分化状态的丧失是导致β细胞身份受损、最终功能改变的基础。2016年贾伟平教授等人在一项中国为期9年的前瞻性研究中该下列结论,即中国人群易患2型糖尿病可能是由于胰岛β细胞功能差而非胰岛素抵抗。因此,对探讨如何改善和恢复胰岛β细胞功能对国人来说是至关重要的。同时越来越多的证据表明,肾素-血管紧张素系统(RAS,renin-Angiotensin system)的病理性刺激与2型糖尿病相关,并且RAS抑制剂可以延缓新发2型糖尿病在其高危人群中的发生。此外,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为一种强大的RAS成分,它不仅使胰岛血流减少,还会引起氧化应激,促炎性细胞因子和胰岛纤维化,而且在AngⅡ灌注的糖尿病鼠中发现胰岛β细胞功能障碍。综前述,既往研究初步揭示了 RAS与2型糖尿病之间的关系,但RAS在糖尿病发生发展的深入机制未被完全了解。研究表明β胰岛细胞衰竭可主要通过以下机制:氧化应激,内质网应激,低氧应激以及促炎细胞因子的诱导。在糖尿病小鼠中,β细胞在应对这些应激时,可能去分化即退化成祖细胞的阶段或转变成其他类型的胰腺细胞。这些变化导致成熟β细胞身份的丧失。同时,在2型糖尿病患者的胰岛中观察到,β细胞去分化常表现为β细胞自身标志物减少和祖细胞标志物表达增加。因此,近来已经认识到完全分化状态的丧失是2型糖尿病中潜在的损害β细胞功能的机制。最近临床试验和实验证据表明,NF-κb是一种主要的转录因子,能够正向调节1型血管紧张素Ⅱ受体(AT1R)基因的表达。除此之外,RAS抑制剂介导的心脏保护作用与抑制NF-Kb通路介导的炎症相关。非活化的NF-κb复合物位于细胞质中,该复合物包括p65亚基和抑制性IκBα,IκBα可以抑制p65入核,在应激反应中,I1κB激酶(IKK)将抑制性亚基IκBα从复合物释放出来后,促进p65向细胞核转移,从而引起基因的转录调控。此外,在多种不同类型的细胞观察到,在AngⅡ刺激下能够引起NF-Kb通路的激活。在以上发现的基础上,本研究想探讨RAS激活在β细胞去分化过程中是否发挥重要作用,以及其相关机制。我们选取胰岛β细胞系Min6和db/db小鼠分别作为体外、体内研究模型,明确RAS系统的激活和胰岛β细胞去分化的关系,及研究阻断RAS或NF-Kb信号通路后,能否有效逆转β细胞去分化,为糖尿病的发病机制和防治策略提供新的理论依据和思维视角。研究方法1.细胞培养将胰岛β细胞系Min6置于RPMI 1640培基中培养,并在37℃,95%空气和5%CO 2培养箱中孵育,当细胞达到70%融合时我们进行后续实验。2.实验动物选用8周龄雄性db/db小鼠和野生型同窝对照(db/m小鼠)购于南京大学模型动物研究中心。3.腹腔葡萄糖耐量检测将小鼠过夜禁食后,给其腹膜内注射202%葡萄糖溶液(1g/kg)。在0,15,30,60和90分钟五个时间点用血糖仪进行检测量尾静脉血液的葡萄糖浓度。同时在0,15,30分钟从眼框血中采集血液,进行后续ELISA试剂盒测试胰岛素。4.葡萄糖刺激胰岛素分泌实验将细胞置于Krebs-Ringer碳酸氢盐HEPES(KRBH)缓冲液进行葡萄糖饥饿准备45分钟。然后,将其孵育在含有3mM葡萄糖KRBH缓冲液60分钟,最后将其置于含有25mM葡萄糖KRBH缓冲液中60分钟。收集孵育过的培养基进行ELISA分析。5.酶联免疫吸附试验然后使用相应的特异性ELISA试剂盒测定培养基和血清的胰岛素或IL6。使用酶标仪在450nm处读取吸光度。6.实时聚合酶链式反应使用2-△△Ct方法通过相对基因表达来确定基因表达。7.蛋白印记Western印迹和免疫组织化学十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹如前所述,使用下列抗体一抗针对FoxO1,Pdx-1,Ngn3,磷酸化IλBα(p-IκBα),IκBα,磷酸化p65(p-p65),p65,β-actin和HRP标记的二抗山羊抗兔IgG和二抗山羊抗小鼠IgG。8.免疫荧光分析对胰腺β细胞和固定蜡包埋的胰腺切片(Smm)进行如下的免疫染色。用Nikon Y-TV55荧光显微镜捕获双重染色的图像。使用Image-Pro分析仪软件测量阳性染色面积占总的胰岛面积的比例。9.统计分析数据表示为均数士标准误差,使用Prism7.0进行统计学分析。对于不同实验组的统计学意义,我们采用单因素或双因素方差分析(ANOVA),P0.05表示有统计学差异结果1.RAS抑制剂对葡萄糖诱导的胰岛β细胞株身份损害的保护作用葡萄糖毒性诱导的β细胞身份的损伤主要表现为:β细胞自身标记物Pdx1,Ins1下调,以及祖细胞标记物Ngn3,Oct4升高和及β细胞功能障碍,胰岛素分泌减少。Irbesartan可部分恢复GSIS水平以及抑制去分化,说明了 RAS抑制剂对葡萄糖诱导的胰岛β细胞株身份损害的保护作用。2.AngⅡ对胰岛β细胞株的去分化作用和NF-Kb信号通路的关系AngⅡ对β细胞的有害作用依赖于NF-κb信号传导。我们发现NF-κb通路抑制剂,sc-514也能显著降低Ngn3,Oct4,IL6mRNA,恢复β细胞身份。AngⅡ诱导NF-κb的激活,导致β细胞的去分化和功能障碍,且干预剂量与NF-Kb通路mRNA水平和蛋白水平正相关,也与β细胞身份损害程度正相关。3.sc-514和Irbesartan对AngⅡ灌注的db/db小鼠的胰岛β细胞的作用AngⅡ加剧了 db/db小鼠体内胰岛β细胞的去分化,而Irbesartan能够挽救β细胞insulin表达的损失,恢复β细胞的自身身份Pdx1表达,从而改善胰岛细胞功能。NF-κb通路抑制剂,sc-514的保护作用主要通过减少祖细胞标记物Ngn3的表达,从而逆转β细胞去分化,并达到最终来改善β细胞分泌功能。结论本研究首次发现RAS可能通过作用于血管紧张素受体1(AT1R),诱导NF-Kb信号通路的激活诱导β细胞去分化。因此,阻断RAS或NF-Kb信号有效地逆转β细胞的去分化状态,为2型糖尿病患者提供的潜在治疗手段。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

炎症因子,标记物,损伤作用,标准化处理

低抑制邋Ｎｇｎ３，Ｏｃｔ４，ＩＬ６ｍＲＮＡ邋（３．７４＋１．１４邋ｖｓ邋２．５３＋邋０．２１，１．８９＋邋０．１邋ｖｓ邋０．８邋＋逡逑０．３，１．９６邋＋邋０．３４邋ｖｓ２．１２邋＋邋０．１７）差异具有统计学意义。说明Ａｎｇｌｌ对０细胞的去逡逑分化损伤作用可能依赖于ＮＦ－Ｋｂ通路的激活。（图２－１及表２－１）逡逑ｇ邋＿邋＊＊＊邋＊＊＊逦２邋５１邋＊＊邋＊＊＊逦ｇ邋＊＊逦＊逡逑＊＊＊逦＊＊＊逦ｉｔ逡逑Ｉ逦Ｔ逦１邋２０＇逦Ａ逦１：６－逦Ｔ逡逑Ｉｆ４．邋１逦｜ｆ１５逦｜１逡逑ｘｌ逦泛逦ＩＩ１５－逦今逦＾邋８逦Ｘ逡逑？邋８逦＜１＞邋８逦Ｔ逦0）邋＞３邋４邋－逡逑Ｃ邋ｏ逦ｆＸｊ邋N逦Ｃ邋艺邋１邋ｏ邋－N邋Ｔ邋Ｔ邋Ｔ逦ｃ邋Ｐ逡逑２－逦ｒｉ逦ｆ１］N邋Ａ逡逑ｃ邋－逦２邋匕逦３逦２－逦．Ｘ．逡逑ｚ逦Ｑ邋０．５－逦ｉ邋Ｉ逦ｄ逡逑。．丨ＱＤＩＪ１Ｊ１Ｊ逦。。１丨」丨‘丨［丨丨，丨１丨逦0ｌｐｌ？ｌｌ，ｌｌＪｌ｜－逡逑Ａｎｇｌｌ逦Ａｎｇｌｌ逦Ａｎｇｌｌ逡逑图２－１邋ｑＰＣＲ检测Ｍｈｉ６细胞去分化标记物Ｎｇｎ３、Ｏｃｔ４邋ｍＲＮＡ、炎症因子ＩＬ６的改变逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－１邋ｑＰＣＲ邋ａｎａｌｙｓｅｓ邋ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ邋ｌｉｋｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋Ｎｇｎ３＞邋Ｏｃｔ４，邋ａｎｄ邋ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｍｔｏｒｙ逡逑ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ邋ＩＬ６邋ｉｎ邋Ｍｉｎ６邋ｃｅｌｌｓ．逡逑上述⑴组Ｍｉｎ６细胞Ｎｇｎ３、Ｏｃｔ４、ＩＬ６邋ｍＲＮＡ的表达，其表达水平标准化处理后为对照逡逑组的倍数。采用ｏｎｅ－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ分析数据

【参考文献】