AT1受体自身抗体在胰岛β细胞损伤中的作用研究

发布时间：2020-09-16 09:50

　　研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)的发病率、死亡率居高不下及发病年龄趋于年轻化使其已成为21世纪全球性的疾病威胁。持续性血糖异常升高及胰岛失代偿是糖尿病发生的最重要因素。已有的研究表明,胰岛β细胞数目减少和(或)功能障碍是胰岛功能难以代偿的重要原因。因此,探究胰岛β细胞损伤机制将成为糖尿病研究的重中之重。凋亡和自噬是细胞为维持机体稳态而进行的自发性死亡过程。适度凋亡和自噬对维持胰岛β细胞数目具有重要意义。然而,有研究证实,凋亡及自噬的过度激活会诱导细胞死亡。作为人体内重要的体液调节系统之一,肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)参与了糖尿病的病理进程。有研究报道,胰腺组织局部RAS系统的激活,特别是Ang Ⅱ的激活,会抑制糖的转运、降低胰岛素分泌及诱导胰岛β细胞凋亡。糖尿病临床资料的数据显示,2型糖尿病患者血清中存在类AngⅡ的物质-血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor autoantibody,AT1-AA)。该抗体首次在1999年被Wallukat等人发现于子痫前期孕妇血清中,之后人们在多种疾病中均发现了AT1-AA的存在。研究AT1-AA的作用机制发现,它可以激活血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin Ⅱ type 1receptor,AT1R)进而发挥类似Ang Ⅱ的作用。因此,存在于糖尿病患者血清中的AT1-AA在糖尿病的病程中,尤其是在胰岛细胞损伤中或可发挥着一定的作用。目的:根据以上研究背景,本课题拟利用AT1-AA阳性大鼠模型研究以下问题:1.AT1-AA长期存在是否能引起血糖及胰岛结构和功能改变从而使糖尿病易感性增加;2.AT1-AA对胰岛β细胞凋亡及自噬的影响,及自噬在凋亡中的作用。方法:1.动物模型建立:AT1-AA免疫组(Immunized group,n=10):用AT1R-ECⅡ肽段主动免疫大鼠;溶剂对照组(Vehicle group,n=10):用等量抗原稀释液(Na_2CO_3溶液和生理盐水)代替抗原溶液。2.亲和层析柱分离纯化含AT1-AA的IgGs。3.SA-ELISA法检测血清中AT1-AA滴度。4.OGTT试验对大鼠免疫过程中葡萄糖耐量进行检测。5.Immunohistochemistry法观察胰岛组织形态结构的变化,胰岛素分泌情况及自噬相关蛋白的水平。6.本文用Western blot法检测了凋亡相关蛋白cleaved caspase 3、caspase 3及自噬指示蛋白LC3、beclin 1、P62的表达情况。7.细胞免疫荧光法检测AT1-AA的特异性。8.Flow cytometry检测AT1-AA孵育后细胞凋亡。结果:1.AT1-AA阳性大鼠模型建立成功SA-ELISA法检测大鼠血清中AT1-AA滴度,结果显示:免疫2W后,免疫组大鼠AT1-AA呈阳性(P0.05),免疫至8W后达到峰值,明显高于同期对照组(P0.05),之后抗体均保持在较高水平(如图1A所示)。SDS-PAGE凝胶电泳检测其纯度,结果观察到,凝胶上呈现两条清晰的条带,即IgG重链、IgG轻链(如图1B所示)。2.AT1-AA阳性大鼠胰岛结构和功能障碍免疫4W之后,AT1-AA免疫组与溶剂对照组的空腹血糖水平无显著差异(P0.05);免疫至8W,与同期对照组相比,AT1-AA阳性大鼠空腹血糖明显升高(P0.05)(如图2A所示)。OGTT试验监测大鼠糖耐量变化,结果显示,主动免疫4W大鼠服糖后2 h血糖降至正常水平,与溶剂对照组结果无差异(P0.05),而主动免疫8W后,大鼠服糖2 h后血糖仍高于7.7mmol/L,提示糖耐量减低(如图2B所示)。除此之外,免疫组化结果观察到:免疫组大鼠胰岛结构排列紊乱,可见淋巴细胞浸润,胰岛素分泌减少(如图2C所示)。以上结果均提示免疫后大鼠糖代谢异常,胰岛结构和功能受损。3.AT1-AA阳性大鼠胰岛组织凋亡和自噬水平升高分别用Western blot方法及Immumohistochemical stainning对大鼠胰岛组织凋亡及自噬水平进行检测,结果显示:与溶剂对照组相比,免疫4w,8w,12w,16w后,胰岛组织cleaved-caspase3/caspase 3比值及LC3、Beclin 1均升高,免疫组化结果示棕色颗粒较多,着色深,而P62表达下降(P0.05),着色浅(如图3所示),该结果表明免疫后大鼠胰岛组织自噬及凋亡水平均升高,胰岛细胞受损。4.阳性血清提纯的AT1-AA可特异性结合于INS-1胰岛β细胞上的AT1R荧光显微镜下观察到呈现红色荧光的AT1-AA与呈现绿色荧光的AT1R的细胞定位结果一致,而Negative-Ig G组未观察到细胞膜上有红色荧光(如图4所示)。该结果证明,阳性血清提纯的AT1-AA为膜抗体,可特异性地结合于AT1R。5.AT1-AA可降低INS-1胰岛β细胞的存活率,且呈浓度依赖性分别用不同浓度(10~(-8)、10~(-7)、10~(-6)、10~-55 mol/L)的AT1-AA或阴性IgG孵育INS-1胰岛β细胞24 h,CCK8法检测细胞存活率。结果显示AT1-AA孵育后的细胞存活率呈浓度依赖性地降低。当处理浓度为10~(-6)、10~-55 mol/L时,AT1-AA组存活率较阴性IgG组显著降低(P0.05)(如图5所示),我们选用10~-66 mol/L作为后期实验的处理浓度。6.AT1-AA诱导INS-1胰岛β细胞凋亡,且可被AT1R拮抗剂所阻滞细胞凋亡检测结果显示,与阴性IgG对照组相比,AT1-AA处理12 h后,细胞凋亡比率明显升高(P0.05),24 h达到峰值,36 h仍高于对照组(如图6A所示)。用20μmol/L替米沙坦预处理细胞之后再给予AT1-AA共孵育24 h,Western blot结果显示AT1-AA诱导细胞凋亡的效应可被阻滞(如图6B所示)。7.AT1-AA可引起INS-1细胞自噬水平升高,该效应可被AT1R拮抗剂所阻断用10~(-6) mol/L的AT1-AA分别孵育INS-1细胞6 h、12 h、24 h、36 h后,用Western blot法检测LC3、beclin1、P62的蛋白水平。结果显示AT1-AA孵育6 h后,相对于阴性IgG组,LC3、Beclin 1的蛋白水平开始升高,12 h继续升高,24 h持续升高到36 h(P0.05),而P62的蛋白水平逐渐降低(如图7A所示)。以上结果表明,AT1-AA可引起INS-1胰岛细胞自噬水平升高,且呈时间依赖性。用替米沙坦预处理细胞之后,AT1-AA诱导细胞自噬升高的效应亦可被阻滞(如图7B所示)。8.升高或降低自噬可以明显改变AT1-AA诱导的细胞凋亡用3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或Rapamycin预处理细胞后,再给予AT1-AA孵育细胞24 h。结果显示,与AT1-AA组相比,抑制自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值下调;而上调自噬后,cleaved caspase 3/caspase3比值上调(P0.05)(如图8所示)。结论:1.AT1-AA长期存在可诱导胰岛组织结构紊乱及分泌胰岛素功能障碍;2.AT1-AA可诱导胰岛β细胞自噬和凋亡升高,自噬上调可能是AT1-AA诱导胰岛β细胞凋亡的原因之一。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

抗体滴度,纯化效果

动物模型建立成功A:两组大鼠血清中抗体滴度水平

空腹血糖水平,大鼠,功能障碍,葡萄糖耐量试验

阳性大鼠胰岛功能障碍A:大鼠空腹血糖水平；B:大鼠葡萄糖耐量试验

自噬,相关蛋白,表达水平,免疫组化

26图 3 阳性大鼠胰岛细胞损伤 A:大鼠胰岛自噬相关蛋白表达水平；B:自噬相关蛋白免疫组化染色结果 C :大鼠胰岛组织凋亡蛋白表达水平*P<0.05，**P<0.01 vs vehicle group, n=6。

【参考文献】