目的:近年来国外的研究发现以18-羟皮质醇(18-OHF)为代表的类固醇激素在醛固酮瘤(APA)患者外周血中明显升高,由于此型患者可通过手术治愈或缓解,有学者认为类固醇激素有望成为早期识别APA的生物标志物,用于筛选真正需要行肾上腺静脉取血(AVS)分型定侧的原发性醛固酮增多症(PA)患者。进一步的研究发现血浆类固醇的升高与KCNJ5基因突变特异性相关联,可能与肾上腺病变组织球状带和束状带样细胞及其酶系表达的程度及差异有关。目前国人的血浆类固醇水平与不同亚型PA及体细胞突变的关系尚不清楚。本研究拟采用液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)测定待分型的可疑单侧型PA患者的血浆18-OHF浓度,与金标准AVS分型结果进行比较,初步评价血浆18-OHF对原发性醛固酮增多症(PA)分型诊断的价值;同时测定手术患者肾上腺病变组织的体细胞突变,进一步分析血浆18-OHF与体细胞突变的关系。为此,1.首先,建立LC-MS/MS定量分析测定血浆18-OHF浓度的方法。2.研究血浆18-OHF水平与不同亚型PA的关系及其对单侧型PA的诊断价值。3.明确目前已报导的5种体细胞突变(KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1)的常见突变位点在手术PA患者中的发生率及其相应的临床表型。4.研究血浆18-OHF水平与体细胞突变的关系。方法:1.通过查阅文献,确定LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的实验方法、条件及技术路线。收集2016年12月在新疆自治区人民医院高血压诊疗中心确诊为PA并经过AVS分型诊断的PA患者血样10份(包括外周血样及肾上腺静脉血样),采用5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX)进行预实验,建立LC-MS/MS测定血浆18-OHF的方法,并进行方法学验证评价其灵敏度、精密度及专属性。2.继续纳入2017年1月至12月在我中心定性诊断为PA、结合肾上腺CT结果疑似为单侧的待分型PA患者,以AVS为金标准进行分型诊断,同时收集研究对象的外周血样,采用预实验成功建立的LC-MS/MS方法测定其外周血18-OHF浓度,分析血浆18-OHF水平与不同亚型PA的关系及其对单侧型PA的诊断价值。3.(1)收集35例手术PA患者的肾上腺瘤体或增生组织,保存于液氮罐中,提取组织DNA,通过设计的6对引物,对目标基因KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-区段1、CTNNB1 exon3六个片段进行PCR直接测序,分析这些片段中的突变位点及其相应的临床表型。(2)分析35例手术患者血浆18-OHF浓度与体细胞基因突变的关系。结果:1.预实验建立的LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的方法具有较好的灵敏度、精密度及专属性,能够对血浆18-OHF进行定量分析,样本制备重复性好,数据稳定可靠,为进一步开展后续研究奠定了坚实基础。2.共纳入45例可疑为单侧型的待分型PA患者,经金标准AVS分型诊断:24例为单侧型PA、21例为双侧型PA。(1)与双侧型PA患者相比,单侧型PA患者的血钾水平较低(3.21±0.45 vs 3.47±0.34 mmol/L,P=0.038);血浆醛固酮浓度(PAC)较高(26.6±8.0vs 21.5±8.8 ng/dL,P=0.051),差异接近统计学意义;两组间年龄、性别比例、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、体重指数(BMI)、醛固酮/肾素活性比值(ARR)、血浆肾素活性(PRA)、空腹血糖、血钠及血肌酐水平无统计学差异(P0.05)。(2)Spearman相关分析显示:PA患者的血浆18-OHF浓度与ARR呈正相关(r=0.37,P=0.013),与PRA(r=-0.32,P=0.034)及血钾(r=-0.31,P=0.04)呈负相关。(3)血浆18-OHF浓度在单侧型PA患者中明显高于双侧型PA患者[2.16(0.73,3.66)vs 0.78(0.14,1.15)ng/mL,P=0.001]。(4)采用二元Logistic回归分析患者年龄、性别、血钾水平、PAC及血浆18-OHF浓度与单侧型PA的关系,结果显示:血浆18-OHF(OR=4.24,P=0.007)、血钾(OR=0.04,P=0.034)对单侧型PA有统计学意义;而PAC、ARR、年龄、性别无统计学意义;提示血浆18-OHF浓度每增加1ng/mL其为单侧型PA的优势比为4.24。(5)ROC曲线分析显示血浆18-OHF诊断单侧型PA的曲线下面积(AUC)为0.806,最佳切点为1.74 ng/mL,敏感性为65.2%,特异性为90.5%,约登指数(YI)为0.557,阳性似然比为6.8,其诊断效能优于经典指标PAC(AUC=0.710,敏感性为73.9%,特异性为66.7%,阳性似然比为4.1)及ARR(AUC=0.588,敏感性为69.6%,特异性为57.1%,阳性似然比为1.6)。(6)以上述血浆18-OHF最佳切点作为分型标准与金标准AVS分型结果进行比较,其阳性预测值为88.2%,阴性预测值为70.3%,两种分型方法的Kappa值为0.55,P0.001,提示两种方法诊断结果的一致性为中等。3.对35例手术PA患者肾上腺组织的KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3、CACNA1D、CTNNB1-区段1、CTNNB1 exon3六个片段进行PCR直接测序分析。(1)基因测序结果:(1)11例PA患者存在KCNJ5基因错义突变(4例G151R,7例L168R),总突变率为31.4%;(2)8例患者存在CACNA1D基因rs117630105 C/T突变,突变率为22.9%;(3)未发现ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1-区段1,CTNNB1 exon3片段存在突变位点。(2)基因突变与临床表型的关系:(1)KCNJ5基因突变型患者中单侧型PA的比例明显高于野生型患者(81.8%vs 45.8%,P=0.049)。KCNJ5突变型患者与野生型相比,其性别比例、年龄、SBP、DBP、PRA、PAC、血钾、24小时尿钾、ARR及肿瘤直径等指标无统计学差异(P0.05);(2)CACNA1D基因突变患者中3例为双侧型PA,5例为单侧型PA,7例为女性,1例为男性,年龄明显小于野生型(44.3±6.2 vs 51.9±8.6岁,P0.05),两组间SBP、DBP、PRA、PAC、血钾、24小时尿钾、ARR及肿瘤直径无统计学差异(P0.05)。(3)血浆18-OHF浓度与基因突变的关系:(1)KCNJ5基因突变患者的血浆18-OHF浓度明显高于野生型[1.95(1.19,2.70)vs 0.73(0.42,1.41)ng/mL,P=0.034];(2)CACNA1D基因突变患者的血浆18-OHF浓度与野生型相比无统计学差异[0.59(0.32,2.70)vs1.15(0.60,2.16)ng/mL,P=0.516];(3)以血浆18-OHF1.74ng/mL为切点,将患者分为高18-OHF组与低18-OHF组,KCNJ5突变在高18-OHF患者中的比例明显高于低18-OHF患者(58.3%vs 18.2%,P=0.017)。而CACNA1D突变比例在两组间无明显差异(25.0%vs 22.7%,P=1.0)。结论:1.本研究成功建立了LC-MS/MS测定血浆18-OHF浓度的方法,具有较好的灵敏度及专属性,能够对血浆18-OHF进行绝对定量,样本制备重复性好,数据稳定可靠,为进一步开展后续的研究奠定基础。2.血浆18-OHF浓度在单侧型PA患者中明显高于双侧型PA患者;与金标准AVS相比,血浆18-OHF对单侧型PA具有一定的诊断价值,但由于样本量小,还需扩大样本量进一步在PA患者中验证。3.35例PA患者中发现KCNJ5基因G151R、L168R突变率为31.4%,CACNA1D基因rs117630105 C/T突变率为22.9%;未发现ATP1A1、ATP2B3、CTNNB1突变。4.血浆18-OHF浓度的升高与KCNJ5基因突变有关,未发现该指标与CACNA1D基因突变存在相关性。
【学位单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R586.24
【部分图文】：
前 言系，还与患者的预后关系非常密切，早期识别 KCNJ5 突变型 APA 患者意义重大由于 IHA 的治疗方式首选药物治疗，肾上腺组织标本不易获取，以往针对 IHA 肾上腺增生组织体细胞突变的研究较少，其发病机制至今尚未阐明。不过，近年的研究在 IHA 方面也取得了一定的进展。Yamazaki Y 等人[72]发现在 CT 阴性（提示肾上腺增生或微腺瘤）的 PA 患者肾上腺组织中发现 L-型电压依赖性钙离子通道α1亚基（CACNA1D）基因突变率高达 65%。近期发表在 Hypertension 杂志的一项研究发现在 15 例 IHA 患者肾上腺增生组织中发现在用 CYP11B2 标记的醛固酮分泌细胞簇（aldosterone-producing cell clusters, APCC）区域中检测到的 CACNA1D 变异率高达 58%，提示不同的体细胞突变参与了不同亚型 PA 的发生发展[73]。
图 1-1 空白溶液 XIC 图谱Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum图 1-2 25ng/mL18-OHF 标准品加入 IS 的 XIC 图谱Fig. 1-2 XIC spectrum of 25ng/mL 18-OHF standard reagent added to IS
建立的色谱-质谱方法能检测到 18-OHF，并且 18-OHF 和 IS 色谱分离，峰形及专属性较好。图 1-1 空白溶液 XIC 图谱Fig. 1-1 blank solution XIC spectrum
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 冯娟;;癌症病因新进展:更多体细胞突变基因被鉴定[J];生理科学进展;2007年02期
2 T.Fujii;冯志杰;;EMS对大豆体细胞突变(M_1)和隐性突变(M_2)的诱变效力[J];核农学通报;1987年01期
3 余穗;夏家辉;李麓芸;;体细胞突变中7号、14号染色体易位[J];遗传与疾病;1989年02期
4 邱瑞霞,陈立清;体细胞突变与染色体断裂综合征的临床研究[J];中国优生与遗传杂志;2004年03期
5 白若红,吴嵩龄;岳阳楼区29例体细胞突变核型分析[J];中国优生与遗传杂志;2003年S1期
6 陈宾;马建婷;陈利玲;洪旭涛;唐晓婧;陈枢青;;腹膜间皮瘤组织体细胞突变的分析[J];浙江大学学报(医学版);2013年04期
7 ;人胰腺癌的APC基因中频发体细胞突变[J];国外医学.遗传学分册;1994年04期
8 郑芳芳;朱理敏;高平进;;体细胞突变在醛固酮腺瘤发病中的作用[J];国际心血管病杂志;2016年01期
9 邓衍明;叶晓青;贾新平;梁丽建;;体细胞突变技术在草坪草种质创新上的最新应用[J];草业科学;2014年09期
10 梁媛;覃君慧;王敬博;王瑞安;;体细胞突变肿瘤发生理论之悖论[J];医学争鸣;2012年04期
相关会议论文 前7条
1 殷杰;杨世伟;朱善良;秦玉明;李军;曹黎明;周凯;程学英;王大为;;心脏发育核心转录因子基因的体细胞突变与散发性先天性心脏病关系的研究[A];2012年江浙沪儿科学术年会暨浙江省医学会儿科学分会学术年会、儿内科疾病诊治新进展国家级学习班论文汇编[C];2012年
2 朱庆;谷丽维;肖珍;彭双清;;一种新的检测体细胞突变的体内试验方法介绍[A];低碳生活与健康损害论坛——中国环境诱变剂学会风险评价专业委员会全国第十三届学术会议暨第四届第5次委员会会议论文集[C];2011年
3 毛建平;董燕;孙志贤;;GPA分析法的建立及其在人体细胞突变检测中的应用[A];中华医学会放射医学与防护学分会第二次中青年专题研讨会论文汇编[C];1999年
4 杨颖;朱自严;;大数据在HLA分型中的应用[A];中国输血协会第八届输血大会论文专辑[C];2016年
5 薛开先;;癌变机制研究的进展[A];中国毒理学会放射毒理专业委员会第七次、中国毒理学会免疫毒理专业委员会第五次、中国环境诱变剂学会致突专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致畸专业委员会第二次、中国环境诱变剂学会致癌专业委员会第二次全国学术会议论文汇编[C];2008年
6 宋怀东;陈凤玲;史文静;宁光;许曼音;胡仁明;陈家伦;;McCune Abright综合征的临床及分子生物学研究[A];中华医学会第六次全国内分泌学术会议论文汇编[C];2001年
7 梁云;周韧;;DLBCL中克隆内超突变主要存在于发生中心来源的DLBCL[A];中华医学会病理学分会2006年学术年会论文汇编[C];2006年
相关重要报纸文章 前1条
1 南方周末特约撰稿 赵威 刘伯宁;揭秘癌症发生全过程[N];南方周末;2012年
相关博士学位论文 前10条
1 骆秦;血浆18-羟皮质醇水平对原发性醛固酮增多症分型诊断的价值及其与体细胞突变的关系[D];新疆医科大学;2019年
2 石丽君;1 原发性肝癌浸润性T淋巴细胞空间异质性分析 2 原发性肝癌患者循环肿瘤细胞检测与预后关系研究[D];北京协和医学院;2017年
3 曹宇;云南省漾濞县先心病流行病学调查及散发房间隔缺损易感基因分析和突变研究[D];昆明医科大学;2016年
4 殷荣;增厚结节型鲜红斑痣的超微结构、体细胞突变及分子机制研究[D];第四军医大学;2017年
5 陈斌;基因重组工具在肿瘤学研究中的应用[D];北京协和医学院;2016年
6 郭荦;结节性硬化症和化脓性汗腺炎致病基因突变筛查和功能研究[D];复旦大学;2013年
7 杨越;mtDNA突变与乳腺癌相关性研究[D];昆明医科大学;2012年
8 凌少平;基于体细胞突变的肿瘤克隆演化动态研究[D];中国科学院北京基因组研究所;2013年
9 花兴;基于癌症基因测序数据的统计方法研究[D];中国科学技术大学;2012年
10 方维佳;全基因组二代测序及甲基化芯片法在探明肠癌患者个体化分子标记物中的应用[D];浙江大学;2013年
相关硕士学位论文 前10条
1 胡颖文;簸箕柳体细胞突变的研究[D];南京大学;2019年
2 卢星宇;个体体细胞突变的等位基因频率揭示癌症相关基因特征[D];上海交通大学;2015年
3 王畅畅;遗传疾病突变的数据挖掘分析[D];安徽大学;2017年
4 吕洋;结直肠癌相关生物标志物的临床病理研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2007年
5 李君;散发性副神经节瘤琥珀酸脱氢酶基因D亚单位体细胞突变的检测[D];青岛大学;2012年
6 孟谊;CastPCR法检测EGFR驱动突变在肺癌中的初步应用探讨[D];南京大学;2015年
7 吴正钢;基于外显子测序的脑部肿瘤体细胞突变分析[D];中国科学院北京基因组研究所;2013年
8 魏巍;5种鲑科鱼类免疫球蛋白轻链序列分析[D];东北农业大学;2009年
9 晋薇;滑膜肉瘤相关生物标志物的临床病理研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
10 任刚;胆囊癌相关生物标志物的临床病理研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
本文编号：
2819982
