环巴胺对体外培养的佐剂性关节炎大鼠关节软骨细胞增殖的影响

发布时间：2020-09-17 12:50

　　背景:关节软骨和骨组织的破坏是类风湿性关节炎(rheumatic arthritis,RA)致残的病变节点,有效的预防和治疗关节软骨和骨组织的破坏是治疗RA的关键环节,可以阻止RA病理发展进程、降低RA致残率。Hedgehog(Hh)信号通路在动物体内普遍存在且进化保守,可调节组织分化、肿瘤形成等。研究表明,在骨性关节炎患者的关节软骨细胞中明显存在Hh信号通路的激活,而Hh信号通路抑制剂环巴胺(cyclopamine)特异性阻断或基因沉默后,可有效缓解骨性关节炎患者的病情,防治骨关节性疾病,但该通路在RA中研究较少。目的:本研究拟建立SD大鼠的佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)动物模型,观察Hh通路抑制剂环巴胺体外对AA大鼠关节软骨细胞增殖的影响,为RA的发病机制提供新的科学依据。方法:SD大鼠40只,随机分为2组,正常组和模型组,每组20只。(1)评价建模后AA大鼠关节软骨受损情况:弗氏完全佐剂足趾皮内注射诱导AA大鼠动物模型,正常组足趾皮内注射等量生理盐水,定期检测并记录关节炎指数和继发性足肿胀度;(2)HE染色:观察正常组、模型组两组关节腔滑膜组织和滑膜下软骨组织生长情况;(3)体外培养关节软骨细胞、鉴定和细胞增殖实验:取AA大鼠踝关节软骨组织,采用胰酶-胶原酶法分离、培养,细胞化学甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学II型胶原染色鉴定培养的软骨细胞;(4)电镜观察:透射电镜观察培养的正常组和模型组大鼠软骨细胞形态特点;(5)细胞增殖实验:环巴胺(0、0.03、0.3、3、10、30μmol/L)体外给药,CCK-8法检测环巴胺处理对AA大鼠软骨细胞增殖的影响;(6)环巴胺体外对软骨细胞的凋亡影响:体外培养软骨细胞,环巴胺(0、0.3、3、10μmol/L)体外给药,应用Hoechst 33258检测环巴胺对AA大鼠软骨细胞凋亡影响;(7)环巴胺体外干预对Hh信号通路的影响:对数生长期的软骨细胞,加入不同浓度的环巴胺(环巴胺终浓度0、0.3、3、10μmol/L)体外培养,Western blot检测环巴胺体外阻断Hh信号通路后,AA大鼠踝关节软骨细胞Shh、Ptch1、Gli1的蛋白表达,图像分析环巴胺体外对大鼠关节软骨细胞Shh、Ptch1、Gli1的蛋白的影响。结果:(1)与正常大鼠相比,AA大鼠关节炎指数和继发性足肿胀度明显升高,(2)HE染色显示,AA大鼠踝关节的关节腔狭窄,关节滑膜组织增生和血管翳形成,炎细胞浸润,滑膜下软骨组织有破坏;(3)软骨细胞鉴定,甲苯胺蓝和II型胶原染色软骨细胞均着色,表明成功体外培养AA大鼠踝关节软骨细胞;(4)透射电镜下,AA模型大鼠软骨细胞胞质中有粗面内质网、高尔基复合体肿胀,线粒体的嵴消失;(5)CCK-8法观察关节软骨细胞增殖结果表明,环巴胺(0.3、3、10μmol/L)体外给药可升高AA模型大鼠关节软骨细胞增殖;(6)Hoechst 33258染色结果显示,环巴胺(0.3、3、10μmol/L)能降低AA模型大鼠软骨细胞凋亡率;(7)Western blot检测结果表明,与模型对照组相比较,环巴胺(0.3、3、10μmol/L)对AA大鼠软骨细胞中Hh信号通路相关蛋白(Shh、Ptch1、Gli1)表达显著下降。结论本实验应用弗氏完全佐剂诱导成功建立AA大鼠模型,体外培养获得AA大鼠踝关节软骨细胞,环巴胺体外给药可促进软骨细胞增殖,抑制软骨细胞的凋亡,该作用与阻逆AA大鼠软骨细胞Hh信号通路有关。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

继发性,炎症,大鼠,前爪

安徽医科大学硕士学位论文22图1 大鼠体征结构改变 A 正常组；B 模型组继发性后爪炎症；C 模型组继发性前爪炎症Figure 1 The symptoms of structures change in rat. A: normal group, B:secondaryinflammatoryof back paw inmodel group, C: secondary inflammation of fore paw in modelgroup4.2 大鼠继发性关节炎评价应用足趾容量仪排水法，通过观察两组大鼠继发侧关节结构，与同期正常组大鼠做比较，测量和记录足爪肿胀度的改变来评价SD大鼠继发性关节炎。足爪肿胀度观察和比较两组大鼠左侧（继发性）的足爪肿胀情况，本组每4天测量一次继发侧足肿胀度，研究表明，与同期正常组比较，AA大鼠于d12左右出现继发侧足肿胀，至3周左右肿胀程度呈逐渐加重趋势，在整个实验期间，正常组大鼠继发侧（未注射PBS侧）的足爪容积基本无异常改变，见图2。

肿胀度,大鼠,继发性,侧足

发侧足肿胀度，研究表明，与同期正常组比较，AA大鼠于d12左右出现继发侧足肿胀，至3周左右肿胀程度呈逐渐加重趋势，在整个实验期间，正常组大鼠继发侧（未注射PBS侧）的足爪容积基本无异常改变，见图2。

关节腔,HE染色,大鼠,滑膜组织

可见单核细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，滑膜组织增生后向其下方的软骨和软骨下骨组织浸润，造成软骨基质中软骨细胞的连续性有破坏，排列紊乱，关节腔狭窄（图3B）。

【参考文献】