肥胖大鼠肝脏生物节律与肠道菌群关系研究

发布时间：2020-09-19 09:04

　　目的:现有研究表明肥胖的发生会影响生物节律的表达水平,同时会造成肠道菌群失调,但是肥胖的生物节律与肠道菌群的相互关系却鲜有报道,本课题探索营养型肥胖模型大鼠肝脏Clock、Per3和Arntl生物钟基因以及Scd1非生物钟基因表达水平和肠道菌群的关系及葛根芩连汤(GQD)的调节作用,从生物节律角度上为GQD预防和治疗高脂饮食诱导的肥胖提供临床用药参考,为糖尿病前期的研究做临床参考。方法:为模拟人类高脂血症伴肥胖发生的饮食行为,本实验通过高脂饮食诱导营养型肥胖大鼠模型,对模型组与空白组分别给予高脂饲料和普通饲料,对造模成功后大鼠进行末端回肠组织病理切片、HE染色和WB实验。对模型进一步进行确定,模型组给予GQD干预,q-PCR(Taq Man)法检测大鼠肝脏的生物钟基因Clock、Arntl、Per3以及脂肪沉积相关酶Scd1基因m RNA转录表达水平。16S r RNA测序技术对大鼠肠道菌群DNA测序,最后,基于生物信息学手段分析生物钟基因Clock、Per3、Arntl以及非生物钟基因Scd1和肠道菌群的关系。结果:1.动物实验结果:给予60%高脂饲料1周后,体重、体长较空白组比较,有显著差异(P0.01),造模第4周,模型组的甘油三酯水平也显著高于空白组(P0.01),GOD干预后12周后,甘油三酯水平明显下降(P0.01)。2.HE染色和WB结果:造模16周后,空白组大鼠回肠黏膜上皮细胞排列紧密,缺损少见。固有膜结构正常,无裂隙发生。肠壁肌层结构正常,与固有层结合紧密。模型组绒毛偏短,排列不均匀,绒毛间脂肪细胞多并且清晰可见。和普通饲料喂养的空白组比较,高脂模型组大鼠的盲肠claudin1、IAP、ZO1蛋白表达量下调,occluding两组表达差异不明显。3.q-PCR结果:给药后12周后,肥胖模型组大鼠肝脏Clock、Arntl基因表达高于空白组(P0.05),Per3、Scd1较空白组低(P0.05),GQD较模型组上调肝脏Clock、Arntl基因表达转录水平(P0.05),对Per3、Scd1的m RNA转录表达水平影响不明显(P0.05)。4.16S r RNA结果:模型组与空白组相比较,菌群种类相同,但比例不同。空白组拟杆菌门最高(56.32%)、厚壁菌门其次(40.32%)、疣微菌门(1.99%)次之。模型组中厚壁菌门最高(57.00%),拟杆菌门其次(33.84%)、疣微菌门次之(7.06%)。在属水平上两组差异较大,空白组norank_f__Bacteroidales_S24-7_group最高(38.59%)、Bacteroides其次(17.03%)、Lachnospiraceae_NK4A136_group(10.31%)次之、unclassified_f__Lachnospiraceae(4.02%);模型组中norank_f__Bacteroidales_S24-7_group最高(23.83%),Bacteroides其次(9.26%)、Clostridium_sensu_stricto_1次之(7.65%)。药物干预后,阳性药组辛伐他汀(SIM)对肠道菌群几乎没有变化,与模型组菌群构造相似,GQD组对肠道菌群结构影响较大。5.Clock、Per3、Arntl生物钟基因以及Scd1基因和肠道菌群关联结果:与Clock成正相关的菌种有4种菌群:Bacteroidales_S24-7_group、Ruminiclostridium_9、Anaerostipes、Tyzzerella、负相关的菌种有3种:vadin BB60_group、Ruminococcus_1、Turicibacter与Arntl成正相关的菌种有8种:Roseburia、Epulopiscium、Blautia、Lachnospiraceae、cellulosilyticus、muciniphila、Peptococcaceae、Ruminiclostridium_9负相关的菌种有9种:Clostridiales_vadin BB60_group、Turicibacter、unclassified_g__Lactobacillus、Ruminococcus_1、Lachnospiraceae_UCG-010、Lactobacillus_johnsonii、Roseburia、leptum_g__norank、Ruminiclostridium与Per3成正相关的菌种有7种:Clostridiales_vadin BB60_group、Ruminococcus_1、unclassified_g__Lactobacillus、Turicibacter、Lactobacillus_johnsonii、Lachnospiraceae、leptum_g__norank负相关的菌种有5种:Lachnospiraceae_UCG-010、Epulopiscium、unclassified_g__Blautia、cellulosilyticus、Peptococcaceae与Scd1成正相关的菌种有3种:Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lactobacillus_johnsonii、vadin BB60_group负相关的菌种有4种:Ruminiclostridium_9、cellulosilyticus、Ruminococcaceae、Bacteroidales_S24-7_group结论:1.高脂饲料诱导的营养型肥胖大鼠造模速度快、时间短。2.营养型肥胖大鼠回肠肠道壁细菌的附着能力下降,肥胖使大鼠肠道紧密连接蛋白claudin1、ZO1和IAP含量表达量下调,对occluding表达改变不明显。3.GQD能明显影上调营养型肥胖大鼠肝脏生物节律基因的表达,中、低剂量组影响给为明显。4.GQD对营养型肥胖大鼠肠道菌群的影响有差别,低剂量使用时,需达到一定时间后才改变菌群结构,中高剂量使用时,对肠道菌群影响迅速,且菌群更相似。5.Clock、Per3、Arntl生物钟基因以及Scd1基因对营养型肥胖大鼠肠道菌群影响较为重要的有Ruminiclostridium_9且与Clock、Arntl基因成正相关,与Scd1成负相关,文献报道该菌群与体重的关系有待进一步确定;vadin BB60_group与Arntl、Scd1基因成正相关,与Clock成负相关,文献报道与肥胖体重有负相关;Ruminococcus_1、Turicibacter与Clock、Arntl基因成负相关,与Per3成正相关,文献报道与肥胖体重有正相关。
【学位单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

生物钟,机体

图 1-1 生物钟与环境的关系re 1-1 relationship between biological clock and environmen对机体的影响通过共用一套分子机制，由相互连接的反馈回路组成（水平进行调节人体的生命活动[39]。正向回路包括 Clock 和们是 E-box 转录因子。它们共同诱导负反馈调节因子、Pchrome (Cry) 1 2 基因组分的转录。Per 和 Cry 蛋白形成一以进入细胞核，抑制时钟和Bmal1(因此也包括Pers和Cr回路涉及到 REV-ERB 和 ROR 家族的核激素受体(NRs)，al1。时钟蛋白的磷酸化状态表现出时间上的变化，并影响、蛋白复合物的形成、它们的稳定性以及转录活性[40]。总生物钟保持恒定的节奏，长期处于黑暗中，机体的生物节

生物钟基因

图 1-2 生物钟基因网络调控图Figure 1-2. Regulation diagram of biological clock gene network节律对肥胖的影响脑中有一个由正反馈和负反馈基因环相互连接而成的中枢时钟，它将活动与一天24小时联系在一起。中枢时钟控制着大多数外周组织中存反馈回路，以协调器官之间的代谢基因表达，并与进食活动协调，从地利用资源。最近的研究阐明了中央和外周时钟之间复杂的反馈机制动和代谢稳态中的作用。脂肪组织是主要的能量储存器官，通过分泌素和内分泌激素向其他器官发出能量状态的信号。在脂肪组织中，时核激素受体之间的转录反馈调节，以及这些分子之间的直接蛋白质联代谢基因在适当的时间表达[46]。肥胖患者表现为机体的脂质堆积，导衡的破坏，生物节律参与了此平衡的调节[47]。瘦素是一种内源性的激脂肪细胞的分泌，在基因转录与蛋白表达水平都表现出生物节律性。

构成图,肠道,构成图,盲肠

图 3-1 肠道紧密连接蛋白构成图Figure 3-1. Composition of intestinal tight junction protein验建立大鼠肥胖模型，对造模成功的大鼠进行末端回肠的病理切察肥胖与正常生理状态的动物末端回肠组织形态与超微结构变化lot 检测盲肠组织蛋白的方法，分析肠道紧密连接蛋白 occluZO1 和肠道碱性磷酸酶 IAP 蛋白水平的变化。方法物：同第二章材料与方法 1盲肠样品采集：第 16 周处理大鼠，分别取回肠与盲肠样本，先找到十二指肠，顺找，空肠下端即为回肠，在与盲肠连接处往上剪 1cm 左右的末端

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