组蛋白甲基转移酶DOT1L在骨质疏松发病中的作用机制研究

发布时间：2020-09-19 10:37

　　 骨质疏松症(Osteoporosis)是骨代谢失衡引起的系统性骨骼疾病,影响数亿人的健康。骨代谢平衡由执行骨吸收功能的破骨细胞和执行骨生成功能的成骨细胞共同维持。因此,研究影响破骨细胞及成骨细胞分化及功能的调节因素是认识骨质疏松发病机理的关键,并为骨质疏松提供潜在的治疗靶点。表观遗传学是指在不改变DNA序列的前提下,通过某些机制引起可遗传的基因表达或细胞表型的变化。有证据表明表观遗传因素调节破骨细胞和成骨细胞的分化,但组蛋白翻译后修饰在破骨细胞和成骨细胞分化中的作用还没有得到深入的研究。本课题前期利用质谱筛选破骨细胞分化前后组蛋白翻译后修饰的改变,发现H3K79me在破骨细胞分化后水平上升,并且DOT1L表达量上调。体外细胞实验表明,利用小分子抑制剂抑制DOT1L的酶活性,或利用shRNA干扰DOT1L表达都能促进破骨细胞分化和骨吸收能力。小鼠体内实验显示,DOT1L抑制剂处理后能够加重卵巢摘除小鼠股骨和胫骨的骨丢失,并且增强骨头中破骨细胞活性。此外,体内和体外实验均表明,DOT1L不影响成骨细胞分化和钙结生成。为了明确DOT1L如何调控破骨细胞分化,RANKL诱导RAW264.7分化作为破骨细胞分化模型,定量蛋白质组学技术用于定量检测DOT1L抑制剂EPZ5676处理后破骨细胞中的蛋白表达变化。结果表明DOT1L主要调节破骨细胞早期分化阶段,并主要调节线粒体蛋白、自噬相关蛋白和细胞骨架调节蛋白。这些差异蛋白与细胞中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)产生、自噬活性和细胞迁移能力密切相关。进一步实验表明DOT1L抑制剂EPZ5676能够增加细胞中ROS水平、上调破骨细胞自噬活性、增强破骨细胞迁移能力。其中,ROS是DOT1L调节破骨细胞分化的关键因子,介导DOT1L对破骨细胞自噬和细胞迁移的调节。此外,DOT1L抑制后还引起其他增强破骨细胞分化和骨吸收的因素改变,例如,破骨细胞中细胞融合蛋白CD9和骨吸收蛋白MMP9表达增强,破骨细胞分化中的重要转录因子NFATc1和NF-κB转录活性增加。综合以上研究结果,本课题发现DOT1L调节的、H3K79me介导的表观遗传调节调控破骨细胞分化,参与骨质疏松发病,提示DOT1L以及DOT1L调节的蛋白网络可以作为治疗骨质疏松的潜在靶点。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：

并收集未诱导的ＲＡＷ２６４．７细胞，破骨细胞（ＴＲＡＰ阳性的多核细胞）和前破骨细胞逡逑（ＴＲＡＰ阳性的单核细胞）。为了筛查组蛋白翻译后修饰在破骨细胞分化中的变化，逡逑本课题利用酸抽提法富集收集三种细胞中的组蛋白，并进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离（图１）。逡逑ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离完成后，切胶分离组蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取纯化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ检测多肽信号。结果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ为参照，组逡逑蛋白Ｈ３赖氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨细胞分化中上调（图２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信号比值由分化前的１：１０变为分化后的１：３。这说明，相对于逡逑未分化状态，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上调了大约３倍。逡逑为了验证质谱结果，同时检测实验结果的可靠性，再次使用同样的诱导方法，逡逑获得ＲＡＷ２６４．７、前破骨细胞和破骨细胞，ＲＩＰＡ裂解细胞获得全细胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ检测Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平变化，结果显示，相对于ＲＡＷ２６４．７细胞，逡逑前破骨细胞和破骨细胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平显著升高

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离完成后，切胶分离组蛋白Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３和Ｈ４，邋Ｔｒｙｐｓｉｎ酶解蛋白后，逡逑萃取纯化出多肽，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ检测多肽信号。结果表明，以Ｈ３Ｋ７９ｍｅＯ为参照，组逡逑蛋白Ｈ３赖氨酸第７９位一甲基化（Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ）水平在破骨细胞分化中上调（图２）。逡逑Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ／Ｈ３Ｋ７９ｍｅ０信号比值由分化前的１：１０变为分化后的１：３。这说明，相对于逡逑未分化状态，Ｈ３Ｋ７９ｍｌ的甲基化水平在分化后上调了大约３倍。逡逑为了验证质谱结果，同时检测实验结果的可靠性，再次使用同样的诱导方法，逡逑获得ＲＡＷ２６４．７、前破骨细胞和破骨细胞，ＲＩＰＡ裂解细胞获得全细胞裂解液。Ｗｅｓｔｅｒｎ逡逑Ｂｌｏｔ检测Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ和Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２的水平变化，结果显示，相对于ＲＡＷ２６４．７细胞，逡逑前破骨细胞和破骨细胞中Ｈ３Ｋ：７９ｍｅ２的水平显著升高，Ｈ３Ｋ７９ｍｅｌ的略有上调（图２）。逡逑这一结果验证了质谱数据，证实了在破骨细胞分化中Ｈ３Ｋ７９ｍｅ水平上升。逡逑根据文献报道

ＥＰＺ００４７７７剂量为１０邋）＿ｉＭ，２０邋ｐＭ和５０邋（ｉＭ时显著抑制破骨细胞生成，表现为逡逑破骨细胞生成数量减少，细胞面积变小。并且，细胞面积随ＥＰＺ００４７７７的浓度增大逡逑而减小（图３）。逡逑ａ逦逦ＥＰＺ００４７７７逦逡逑ＤＭＳＯ逦１邋ｌ＿ｉＭ逦１０邋ｊ．ｉＭ逦２０邋ｌｉＭ逦５０逡逑？邋ｔ”＇逦？．，知．ｖ逡逑／ｒ邋Ｙ逦＊４－＊逡逑二？邋。逡逑ｂ逦ｃ逡逑ｉｔ邋４０１逦＾邋４0ｎ逡逑｜逦§，逦ｔ邋＊逦－邋ＤＭＳＯ逡逑Ｓ邋３0－邋－ｒ逦－邋３０．邋丁逦Ｔ逦■邋ＥＰＺ００４７７７邋１邋ｌｉＭ逡逑￥邋N丁逦Ｓ逦Ｉ逦ｍ邋ＥＰＺ００４７７７邋１０邋ＭＭ逡逑Ｆ２０．邋■邋ｔ邋＊＊邋Ｔ邋？２0－邋Ａ逦＊＊＊逦ＥＰＺ００４７７７邋２０邋ｍＭ逡逑§逦■逦＇逦＾逦％逦■逦＿邋丁逦■邋ＥＰＺ００４７７７邋５０邋ｍＭ逡逑ｄ逦0逦ｓ邋１逦ｅ逦ｏ逦５？逡逑＾逦１邋ｔ邋ｏ逦＾邋ｆ邋＾邋ｏ逡逑ｋＤａ逦ｋＤａ邋0邋＾逦２逦２逡逑１５－邋ｍｍ邋ｍａｍ邋—逦Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１邋１５￣邋ｍｍ邋ｍｍ邋ｍｍ邋—邋Ｈ３Ｋ７９ｍｅ２逡逑１０—逦—Ｈ４逦１０—逦Ｈ４逡逑图３：邋１％邋ＦＢＳ培养条件下ＤＯＴ１Ｌ抑制剂ＥＰＺ００４７７７对破骨细胞分化作用的影响。ＲＡＷ２６４．７逡逑培养在含有１％邋ＦＢＳ的ｏｔ－ＭＥＭ中，细胞铺板密度为１．５ｘｌ0５邋Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ，在３０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＲＡＮＫＬ刺逡逑激下诱导成为破骨细胞。不同浓度的ＥＰＺ００４７７７加入含有ＲＡＮＫＬ的培养基中，检测其对破骨逡逑细胞分化的影响。ａ

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