高甘油三酯饮食诱导甲状腺功能减退的机制研究

发布时间：2020-09-21 11:31

　　研究背景:甲状腺功能减退(简称甲减)是一种常见的且具有潜在严重危害的甲状腺疾病,是由甲状腺激素的合成或分泌减少、或甲状腺激素的效应降低造成的机体低代谢疾病,主要表现为血清甲状腺激素水平下降和促甲状腺激素(thyrotropin,TSH)水平升高。甲减最常见的原因为甲状腺本身的功能异常,即原发性甲减,主要的致病因素有甲状腺自身免疫性疾病、甲状腺碘治疗和手术后、环境因素及抗甲药物等。甲减通常隐匿起病,无特异性临床症状,但可同时影响全身器官。严重甲减如不治疗可导致心脏衰竭、精神异常和昏迷。甲状腺,作为人体重要的内分泌器官,主要功能为合成及分泌甲状腺激素。甲状腺的功能性单位为甲状腺滤泡,由滤泡腔及环绕其周围的滤泡上皮细胞构成。甲状腺激素的合成依赖于三个关键分子正常的功能:甲状腺球蛋白(Thyroglobulin,Tg)、钠碘同向转运体(Sodium iodide symporter,NIS)和甲状腺过氧化物酶(Thyroid peroxidase,TPO)。甲状腺球蛋白是甲状腺激素的前提,为激素合成提供骨架,由甲状腺滤泡上皮细胞合成并分泌至滤泡腔储存,是甲状腺滤泡上皮细胞最主要的分泌型糖蛋白。正常情况下,甲状腺滤泡上皮细胞合成并分泌极大量的甲状腺球蛋白以满足激素合成的需要。既往研究发现,在多例甲状腺球蛋白基因突变疾病中,甲状腺球蛋白缺乏及功能异常可导致甲减及先天性甲状腺肿。钠碘同向转运体,介导碘从血液循环向甲状腺滤泡上皮细胞的逆向转运。甲状腺过氧化物酶,主要催化甲状腺球蛋白酪氨酸残基的碘化和偶联,以合成四碘甲腺原氨酸(thyroxine,T4)和三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)。甲状腺激素的正常合成与此三种蛋白功能密不可分。甲状腺滤泡上皮细胞含有丰富的内质网。早期研究即发现,甲状腺功能减退属于内质网储存性疾病(ER storage diseases,ERSD),与错误折叠蛋白质在内质网内堆积有关,提示了内质网功能异常与甲状腺功能减退的联系。内质网是细胞合成加工蛋白质的主要场所,其正常功能的维持依赖于内质网稳态。任何生理或病理性刺激所导致的内质网稳态的紊乱都会引起内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress),蛋白质发生错误折叠和堆积,从而诱发一系列反应,称为非折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)。UPR需要三个内质网膜上的应激感受分子参与:PKR-like ER kinase(PERK),activating transcription factor 6(ATF6)和 Inositol-requiring enzyme 1(IRE1).。三个分子的激活可抑制蛋白质合成,促进分子伴侣转录,并诱导蛋白质降解。严重持续的内质网应激可导致细胞凋亡。脂质,具有重要的生物学功能,参与构成生物膜、储存能量、调控基因表达并介导细胞通路。过去研究发现,脂质代谢紊乱对于代谢性疾病的发生起重要作用,包括血脂异常、胰岛素抵抗、腹型肥胖和高血压等。代谢综合征的发生与肥胖的严重程度紧密相关,其致病主要由遗传因素及饮食习惯等所导致,尤其是摄取高热量、高脂高糖饮食。多项研究表明,过量脂质的摄入可导致多种器官的功能紊乱和疾病的发生,如脂肪组织代谢、肝脏脂质沉积、胰腺功能障碍等。脂质代谢紊乱对其他器官功能的影响仍待进一步研究。近年研究发现,过量脂质摄入和肥胖所相关的脂质代谢紊乱可能参与甲减的发生,揭示了脂质对甲状腺功能可能造成的影响。Shao的研究发现,饮食中高猪油的摄入导致大鼠血清T4下降,同时伴有TSH的升高和甲状腺形态学异常改变。Shong研究发现,高脂饮食诱导肥胖小鼠、ob/ob小鼠和db/db小鼠表现为不同程度的原发性甲减,甲状腺内脂肪样沉积和甲状腺滤泡上皮细胞脂肪样变。这些研究均提示脂质代谢紊乱参与甲状腺功能减退。但是,其具体发生机制,及过量脂质摄入对甲状腺脂质谱的影响仍少有报道。本研究中,一方面通过体内与体外实验,观察高甘油三酯饮食(简称高脂饮食,Highfatdiet,HFD)喂养大鼠甲状腺功能改变,检测高脂导致甲状腺激素合成关键分子及内质网应激通路指标,探讨脂代谢紊乱导致甲减发生的具体机制;另一方面,通过对高脂饮食大鼠甲状腺脂质组学的研究,观察高脂饮食对大鼠甲状腺组织脂质谱的影响,以期识别高脂饮食导致甲减的关键作用脂质分子,为甲减机制研究提供新的思路。研究目的:1.体内研究观察高脂喂养大鼠血清甲状腺激素和甲状腺激素合成关键分子改变,观察高脂饮食对甲状腺组织内质网应激的影响,体外研究通过棕榈酸处理人甲状腺原代细胞,观察脂质对内质网及Tg蛋白的影响,明确脂代谢紊乱对甲状腺的影响,探讨甲减发生的可能机制。2.通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS),研究高脂喂养大鼠甲状腺组织脂质谱的改变,以期识别高脂导致甲减的关键脂质分子,为脂代谢紊乱导致甲减机制提供新的思路。研究方法:第一部分高甘油三酯饮食通过诱导内质网应激导致甲状腺功能减退的机制研究1.动物模型建立:1.1高脂饮食模型:通过普通对照饮食或高脂饮食喂养雄性SD大鼠模型,于8周、18周分别进行锁骨下静脉取血,检测血清甲状腺相关激素;1.2抑制内质网应激处理模型:自高脂饮食或对照饮食造模第9周开始,分别给予4-苯基丁酸(4-PBA)或对照溶媒磷酸盐缓冲液(PBS)腹腔注射,共]0周,观察相应指标;1.3撤除脂质模型:自高脂饮食或对照饮食造模第9周开始,高脂饮食组改为对照饮食,继续喂养10周后观察相应指标。2.通过24小时放射性碘摄取实验评估甲状腺功能:于造模18周进行评估甲状腺功能,腹腔注射1μCi[1311],24h后处死大鼠并测定甲状腺组织放射性,以每单位重量甲状腺组织摄取碘的百分比来评估甲状腺功能。3.甲状腺形态学观察:通过HE染色及透射电镜,观察甲状腺一般病理形态和超微结构变化。4.甲状腺激素合成关键分子mRNA水平的评估:通过Real time-PCR检测Tg、Nis、Tpo、Ttf1、Pax8、Hex 的 mRNA 水平变化。5.甲状腺激素合成关键蛋白表达水平的评估:通过Western Blotting观察Tg、NIS、TPO在甲状腺组织的蛋白水平变化。6.内质网应激指标的激活水平评估:通过Western Blotting观察eIF2a、IRE1、ATF6在甲状腺组织和人甲状腺原代细胞的蛋白激活水平变化。7.Tg糖基化修饰的评估:通过应用两种酶(endo H和PNGase F)进行消化人甲状腺原代细胞,观察棕榈酸处理下Tg的糖基化修饰的变化。8.Tg降解水平的评估:通过抑制蛋白酶体降解途径,观察能否改善棕榈酸导致的Tg下降;通过抑制新生蛋白合成,观察Tg降解速率变化。9.改善内质网应激的治疗作用评估:通过给予内质网应激抑制剂(于造模第9周开始至18周)或撤除饮食脂质(于造模第9周开始至18周),观察内质网应激的指标、Tg及甲状腺功能的变化。第二部分高甘油三酯饮食影响甲状腺脂质谱的研究1.样本收集:普通对照饮食或高脂饮食喂养大鼠18周,处死并留取甲状腺组织,液氮保存。2.脂质组学研究:采用UPLC-MS/MS,检测分析大鼠甲状腺组织脂质分子差异。研究结果:第一部分高甘油三酯饮食通过诱导内质网应激导致甲状腺功能减退的机制研究1.高脂饮食组大鼠体重显著高于对照饮食组。造模8周后,高脂饮食组大鼠血清TSH较对照饮食组显著升高,血清TT4无显著差异;造模18周后,高脂饮食组大鼠血清TSH较对照饮食组显著升高,同时TT4较对照饮食组显著下降。2.高脂饮食组大鼠24小时放射性碘摄取较对照饮食组明显下降,提示高脂饮食导致甲状腺功能下降。3.高脂饮食组大鼠甲状腺滤泡腔增大,滤泡上皮呈扁平状,提示功能为低活跃状态。电镜结果显示,高脂饮食组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞核周池增宽肿胀,可见向胞质突出的小泡;内质网肿胀,内质网池扩张,提示内质网病变及功能异常。4.高脂并未导致Tg、Nis、Tpo的mRNA表达下降,甚至可见高脂饮食组大鼠Top mRNA水平的升高,提示高脂导致的甲减发生并非由于三个激素合成分子的转录水平下降引起。与此一致的是三个分子的上调转录因子Ttf1和Pax8两组无显著差异,而下调转录因子Hex表达下降。5.Western blotting结果显示,激素合成三分子Tg、NIS、TPO中,高脂主要引起了 Tg蛋白的显著下降。6.高脂饮食导致甲状腺发生内质网应激。Western blotting结果显示,在高脂饮食组大鼠甲状腺组织和棕榈酸处理人甲状腺原代细胞中,eIF2a磷酸化水平升高,提示此通路的激活。7.通过应用两种酶(endo H和PNGase F)进行消化水解N-连接糖,发现棕榈酸处理细胞的endo H敏感型Tg比例高于对照组,提示Tg糖基化修饰程度低,Tg滞留内质网。8.抑制蛋白酶体作用,棕榈酸诱导的Tg下降得到改善。通过应用放线菌酮抑制新生Tg后,棕榈酸处理细胞较对照组Tg降解增快,提示高脂可促进Tg的降解。9.通过应用4-PBA抑制内质网应激,高脂饮食大鼠的Tg水平及甲状腺功能得到改善。自第9周开始撤除高脂饮食,10周后撤脂组大鼠也表现为内质网应激缓解,Tg水平及甲状腺功能改善。第二部分高甘油三酯饮食影响甲状腺脂质谱的研究1.高脂饮食造模18周导致甲状腺总游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)增加,其中单不饱和脂肪酸(Mono-unsaturated FA,MUFA)显著升高。高脂饮食组大鼠FFA 18:1和FFA 22:3显著高于对照饮食组。2.高脂饮食组大鼠甲状腺总甘油三酯(Triglyceride,TG)含量与对照组无统计学差异。针对使用多不饱和TGs计算不饱和指数时,高脂饮食组大鼠的TGs不饱和指数较对照饮食组显著降低,提示多不饱和脂酰链呈下降趋势。高脂饮食组大鼠中,单不饱和甘油三酯中TGs 52:1,54:1,54:2,54:3,56:2和56:3显著升高,而饱和甘油三酯TG 52:0也呈现显著升高。3.高脂饮食组大鼠总甘油二酯(Diaglyceride,DAG)水平与对照组无显著差异。高脂饮食组DAG(36:1)和DAG(38:2)较对照饮食组显著升高。4.高脂组大鼠总的磷脂水平与对照组无显著差异。磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE),磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)的总量两组无显著差异。心磷脂(cardiolipin,CL)总量及具体分子在两组间无差异。高脂饮食组升高的磷脂分子有PG(36:2)、PG(40:6)和PI(36:3),但更多分子在高脂组中表现为下降,包括PC(34:2)、PC(40:6)、PE(34:2)、PE(38:6)、PE(40:7)、PE(40:8)、PG(36:4)、PG(38:6)、PG(40:8)、PG(42:10)、PG(44:12)、PI(34:2)、PI(37:4)、PI(38:8)和 PI(39:4)。5.高脂大鼠甲状腺溶血磷脂水平较对照组显著升高,表现为溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholines,LPC)升高,其中 LPC18:0 和 18:1 显著升高。6.总神经酰胺(ceramides,Cers)和总鞘磷脂(sphingomyelin,SM)在两组大鼠间无显著差异。其中,高脂组Cer(dl8:1/18:0)、Cer(d18:2/20:0)、SM(d16:0/20:1)、SM(d16:0/20:2)和 SM(d16:0/22:2)较对照组显著升高,而 SM(d16:0/17:1)、SM(d16:0/24:2)、SM(d16:0/26:1)、SM(d16:0/26:3)、SM(d20:0/19:1)和 SM(d22:0/19:1)显著下降。研究结论:1.高脂饮食通过诱导内质网应激导致Tg下降和甲状腺功能减退;缓解内质网应激可改善高脂导致的Tg水平下降和甲状腺功能减退。2.高脂饮食导致甲状腺组织脂质谱的改变。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R581.2
【部分图文】：

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