IL-34在桥本甲状腺炎发病机制中的作用及机制研究

发布时间：2020-09-21 16:52

　　前言:桥本甲状腺炎(Hashimoto’s Thyroiditis,HT),又称桥本病,是一种器官特异性的自身免疫疾病,患者甲状腺组织内可见大量的淋巴细胞浸润,是临床中导致甲状腺功能减退最重要的病因之一。目前关于HT的相关研究逐渐增多,其中炎症因子对HT的影响起着十分重要的作用。IL-34作为CSF-1R的配体被发现,目前的研究表明IL-34在神经元保护、骨退行性疾病、延迟超敏反应、感染、肿瘤和器官移植中均发挥着作用。此外,IL-34对炎性疾的发生、发展有着重要的影响,如炎症性肠病(IBD)和类风湿性关节炎(RA)等。本课题前期研究提示桥本甲状腺炎患者甲状腺组织中IL-34 mRNA的水平显著低于非桥本甲状腺炎患者,提示IL-34可能参与了HT的病理生理过程。本研究旨在明确IL-34在HT中的变化,探讨IL-34在HT中可能的作用机制。研究方法:本研究收集行甲状腺切除术患者的癌旁或结节旁甲状腺组织,根据患者甲状腺病理结果分为桥本甲状腺炎组(HT组,n=24)和非桥本甲状腺炎组(非HT组,n=23)。收取桥本甲状腺炎病患者(HT组,n=35)及健康对照人群(Control组,n=21)的外周血。免疫组化的方法观察IL-34在甲状腺组织的表达;实时定量PCR(RT-PCR)检测甲状腺组织IL-34 mRNA水平的表达,Western Blot检测甲状腺组织IL-34蛋白的表达水平;使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中IL-34的水平;干扰素-γ(IFN-γ)刺激Nthy-ori 3-1细胞,RT-PCR和Western Blot检测,观察在Nthy-ori 3-1细胞IL-34表达的变化。培养HT患者的原代甲状腺细胞,流式细胞分析甲状腺细胞的凋亡比例,观察HT患者原代甲状腺细胞IL-34刺激后甲状腺细胞凋亡比例变化情况;通过RT-PCR和Western Blot检测IL34刺激后的原代甲状腺细胞中Bcl-2/Bax表达的变化;RT-PCR检测和Western Bolt,在IL-34刺激的同时抑制CSF-1R,观察原代甲状腺细胞中STAT3磷酸化水平的变化情况,此外,在原代甲状腺细胞中抑制STAT3,观察IL-34对甲状腺细胞凋亡相关指标Bcl-2/Bax表达的影响。本研究应用NOD.H-2~(h4)小鼠建立自发性自身免疫性甲状腺炎(spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT)模型,选择4周龄NOD.H-2~(h4)小鼠,随机分为对照组(Contro1组,n=16)和自发性自身免疫性甲状腺炎组(SAT组,n=16)。Control组喂以普通无菌水;SAT组小鼠给予含0.05%碘化钠的无菌水8周诱导发生自发性自身免疫性甲状腺炎;根据喂养时间分为:喂养8周组和喂养16周组,共计4组,小鼠于4周龄时启动高碘喂养。取甲状腺组织行HE染色,RT-PCR和Western Blot检测IL-34的表达情况。结果:1.免疫组化染色显示IL-34表达在甲状腺滤泡上皮细胞,在HT组患者的甲状腺组织中不仅甲状腺滤泡上皮细胞可见IL-34的表达,浸润的炎症细胞也可见IL-34的表达2.HT患者的甲状腺组织中IL-34的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(P0.05),且IL-34的mRNA表达水平与TPOAb和TgAb水平均呈显著负相关(P0.05)。3.血清中HT组IL-34的水平明显低于对照组(P0.05),且血清IL-34的水平与TgAb水平呈显著的负相关(P0.05)。4.HE染色提示SAT组NOD.H-2~(h4)小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎,SAT组甲状腺组织内发现淋巴细胞浸润明显。5.RT-PCR和Western Blot结果显示与同周龄对照组小鼠比较,SAT组小鼠甲状腺组织IL-34的表达水平明显降低(P0.05);6.RT-PCR和Western Blot结果显示IFN-γ刺激Nthy-ori 3-1细胞,导致Nthy-ori 3-1细胞IL-34表达明显降低(P0.05);7.IL-34刺激后的原代甲状腺细胞凋亡比例较对照组显著降低(P0.05),RT-PCR和Western Blot结果显示IL-34单独刺激组凋亡相关指标Bcl-2/Bax显著高于对照组(P0.01,P0.01);8.在IL-34刺激的原代甲状腺细胞中,特异性的抑制CSF-1R后,IL-34+CSF-1R抑制组甲状腺细胞的凋亡比例较IL-34单独刺激组明显升高(P0.05),RT-PCR和Western Blot结果显示IL-34单独刺激组凋亡相关指标Bcl-2/Bax显著高于IL-34+CSF-1R抑制组(P0.01,P0.05),同时IL-34单独刺激组STAT3磷酸化的水平较对照组显著升高(P0.01),IL-34+CSF-1R抑制组STAT3磷酸化的水平较IL-34单独刺激组显著降低(P0.01);9.特异性的抑制STAT3后,RT-PCR和Western Blot结果显示IL-34+STAT3抑制组凋亡相关指标Bcl-2/Bax较对照组显著降低(P0.05,P0.05),IL-34+STAT3抑制组凋亡相关指标Bcl-2/Bax较IL-34单独刺激组显著降低(P0.01,P0.05)。结论:1.本研究发现HT患者和SAT小鼠甲状腺组织IL-34表达及患者血清IL-34水平均显著低于对照组,且IL-34表达量与甲状腺自身抗体水平负相关;IFN-γ刺激致甲状腺细胞IL-34分泌的减少,综上所述提示IL-34降低可能与甲状腺细胞炎症损伤有关。2.经IL-34刺激后HT患者的甲状腺细胞凋亡比例显著降低,提示IL-34可以抑制HT患者甲状腺细胞的凋亡,并且可能是CSF-1R/STAT3/p-STAT3信号参与介导来实现的。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R581.4
【部分图文】：

配制方法,标准品,浓度梯度

95℃ （升温速率 0.11℃/秒，采集模式：持续）1cycle降温 50℃ 30sec（升温速率 2.2℃/秒）1cycle2.3.3 ELISA 方法检测血清IL-34水平ELISA检测血清中IL-34 的水平1）取出-80℃冻存的血清标本，置于冰上融化；2）取人IL-34试剂盒，于室温放置30min；3）用ddH2O将20×的Wash Buffer稀释为1×的Wash Buffer，待用；4）按照说明书上将IL-34标准品按照标签提示配制成终浓度为100 ng/ml，缓慢摇晃15min使其完全溶解；5）待标准品完全溶解后，根据图2.1的方法配制不同浓度梯度的标准品；

免疫组化染色,滤泡上皮细胞,博士学位论文,患者

中国医科大学博士学位论文TSH(mU/ml) 1.20(0.97-1.68) 1.33(1.01-2.14) 0.062FT3(pmol/L) 4.88±0.45 4.45±0.73 0.056FT4(pmol/L) 13.43±1.63 12.84±1.94 0.649TPOAb(IU/mL) 0.40(0.21-0.65) 102.63(5.53-304.96) <0.001TgAb(IU/mL) 1.33(1.10-2.27) 29.01(9.76-225.91) <0.001参考值范围: FT4: 9.01-19.05 pmol/L; FT3: 2.63-5.70 pmol/L; TSH: 0.35-4.94 mU/mL; TPOAb:0.00-5.61 IU/mL; TgAb: 0.00-4.11 IU/mL3.1.2 甲状腺组织中存在 IL-34 的表达非 HT 组患者（n=6）的甲状腺滤泡上皮细胞可见 IL-34 的表达，在 HT 组患者（n=6）的甲状腺组织中滤泡上皮细胞和炎症细胞均有 IL-34 的表达（如图 3.1）。

表达水平,负相关

HT 组(n=10)甲状腺组织中 IL-34 的蛋白表达水平显著低于非 HT 组(n=10)（P< 0.05）（如图 3.2）。图3.2 人甲状腺组织IL-34蛋白的表达水平HT 组(n=23)甲状腺组织中IL-34的mRNA水平显著低于非HT组(n=24)（P <0.05）；Spearman相关分析提示IL-34 mRNA的表达水平与甲状腺自身免疫抗体TgAb（r=-0.356, P = 0.019）和 TPOAb（r=-0.365, P = 0.015）均呈显著负相关（如图 3.3）

【相似文献】