高糖环境对成骨分化的影响及相关信号通路和表观遗传变化

发布时间：2020-10-11 00:56

　　 糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病。目前对于糖尿病状态下骨代谢紊乱的机制尚未明确。研究高糖环境对于不同细胞成骨分化的影响机制对其临床应用有重要的意义。有研究表明,糖尿病患者的骨代谢异常也可能与炎症环境有关。IL-10是一种强效抗炎细胞因子,研究其对于成骨分化的影响也具有重要意义。而高糖和IL-10如何调控成骨分化目前尚不清楚,而微环境的改变如何影响成骨分化过程中的表观遗传修饰也尚不清楚,研究高糖环境对于成骨分化的影响及其调控的机制和表观遗传表达有重要的意义。目的:研究高糖环境对成骨分化的影响及相关信号通路和表观遗传变化方法:第一部分:高糖环境对成骨前体细胞及脂肪干细胞成骨分化的影响分离培养小鼠成骨前体细胞(MPC)、棕色脂肪干细胞(B-ASCs)、白色脂肪干细胞(W-ASCs),复苏MC3T3-E1细胞系,分别给予不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨诱导分化后采用碱性磷酸酶(ALP)染色观察不同细胞成骨分化程度。取成骨前体细胞分别成骨诱导分化,采用qPCR检测成骨分化相关基因的表达水平。采用Western blot检测成骨相关蛋白的表达。第二部分:高糖环境对IL-10低表达导致的成骨抑制的作用分离培养WT MPC和IL-10tml/tmlMPC,分别给予不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨诱导分化7d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色观察不同细胞成骨分化程度,采用定量PCR检测成骨分化相关基因表达水平。取WT小鼠和IL-10tml/tml小鼠颅骨组织,采用microCT及定量PCR分析颅骨发育差异。第三部分:高糖环境通过STAT3通路调节细胞成骨分化过程并影响表观遗传相关蛋白的表达给予WTMPC不同浓度葡萄糖(5.5mmol/L、25mmol/L和55mmol/L)刺激,成骨诱导分化7d,采用Western Blot检测成骨通路相关蛋白和表观遗传相关蛋白的表达。分别给与WT MPC和IL-10tml/tml MPC 25mmol/L葡萄糖刺激,成骨诱导分化7d,采用Western Blot检测成骨通路相关蛋白和表观遗传相关蛋白的表达。结果:第一部分:高糖环境对成骨前体细胞及脂肪干细胞成骨分化的影响1.MC3T3-E1、MPC和W-ASCs的成骨分化能力随着糖浓度的升高而升高,而B-ASCs的成骨分化能力则受到抑制。2.高糖促进了 MPC的成骨分化能力,成骨诱导培养3d和7d后,随着糖浓度的升高,成骨相关基因和蛋白的表达也随之升高。第二部分:高糖环境对IL-10低表达导致的成骨抑制的作用3.相较于WTMPC,IL-10 tml/tml MPC体外成骨分化能力明显下降。4.相较于WT小鼠,IL-10tmltml小鼠的颅骨骨质更为疏松,颅骨组织成骨相关基因表达更低。5.在IL-10tml/tmlMPC诱导过程中补充25mmol/L葡萄糖,可以部分回复其成骨分化能力。第三部分:高糖环境通过STAT3通路调节细胞成骨分化过程并影响表观遗传相关蛋白的表达1.随着葡萄糖浓度升高,MPC的p-STAT3的表达被抑制,而STAT3总表达量无明显差异,H3K4me3和H3K9ac的表达升高,而H3K27me3的表达降低。2.IL-10低表达后p-STAT3和STAT3明显被激活。3.补充 25mmol/L 葡萄糖后,WT MPC 和 IL-10 tml/tml MPC 的 p-STAT3 表达明显降低,H3K4me3和H3K9ac的表达升高,而H3K27me3的表达降低。结论:高糖环境对于不同细胞成骨分化的影响不同。高糖促进成骨前体细胞的成骨分化,并且可以一定程度上挽救IL-10低表达后的成骨抑制作用。高糖环境抑制p-STAT3表达,并通过STAT3通路促进MPC成骨分化。IL-10低表达后激活p-STAT3的表达,说明IL-10通过STAT3通路调控细胞成骨分化进程。高糖影响了成骨前体细胞成骨分化过程中表观遗传修饰蛋白的表达。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：

图１成骨前体细胞系和原代成骨前体细胞培养Ｏｄ和７ｄ后的ＡＬＰ染色（５Ｘ）??Ｆｉｇ．?１．?ＡＬＰ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｆ?ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１?和?ＭＰＣ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?ｆｏｒ?０?ａｎｄ?７?ｄａｙｓ?（５Ｘ）??２．脂肪干细胞的表型鉴定和多向分化能力鉴定??本实验分离培养了白色脂肪干细胞（Ｗ－ＡＳＣｓ）和棕色脂肪干细胞（Ｂ－ＡＳＣｓ），并??通过流式细胞术对其干细胞特性进行了鉴定。结果显示，提取的Ｂ－ＡＳＣｓ和Ｗ－ＡＳＣｓ??均表现为Ｓｃａ－１、ＣＤ２９阳性，ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ８６和ＭＨＣＩＩ阴性，符合文献对脂??肪干细胞表型的报道［２７，２８］（图２Ａ）。??Ｗ－ＡＳＣｓ和Ｂ－ＡＳＣｓ均具有成骨和成脂分化能力，提示其具有干细胞的多向分化??潜力（图２Ｂ、Ｃ）。??

通过流式细胞术对其干细胞特性进行了鉴定。结果显示，提取的Ｂ－ＡＳＣｓ和Ｗ－ＡＳＣｓ??均表现为Ｓｃａ－１、ＣＤ２９阳性，ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ８６和ＭＨＣＩＩ阴性，符合文献对脂??肪干细胞表型的报道［２７，２８］（图２Ａ）。??Ｗ－ＡＳＣｓ和Ｂ－ＡＳＣｓ均具有成骨和成脂分化能力，提示其具有干细胞的多向分化??潜力（图２Ｂ、Ｃ）。??２１??

?解放军医学院硕士学位论文???３．髙糖环境促进成骨前体细胞的成骨分化??本实验对比了不同葡萄糖浓度环境下成骨前体细胞系ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１和原代分离的??成骨前体细胞（ＭＰＣ）的成骨分化能力。??ＡＬＰ染色结果显示，随着葡萄糖浓度的升高，成骨前体细胞系ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１和成??骨前体细胞（ＭＰＣ）着色程度更深、着色斑点数量更多，提示成骨分化能力有所提高，??而不同糖浓度刺激原代分离的成骨前体细胞ＭＰＣ后组间成骨分化能力差异更加明显??（图?３）。??５．５?２５?５５???
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本文编号：2835802