白花鬼针草花粉变应原的分离纯化及小鼠过敏性哮喘及鼻炎的实验性研究

发布时间：2020-10-11 07:20

　　 目的验证白花鬼针草花粉变应原的致敏性,分离纯化其花粉变应原,分别建立各纯化变应原过敏性哮喘及鼻炎模型并用葎草花粉粗提液致敏组作为对照,验证模型建立的成功与否,比较各组模型之间过敏反应程度,分析各纯化变应原的致敏性。方法采集新鲜白花鬼针草花粉,液氮研磨提取白花鬼针草花粉粗蛋白及律草花粉粗蛋白,离子交换层析法纯化百花鬼针草花粉粗蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹法(Western-blotting)验证花粉粗提液变应原及纯化变应原的免疫原性。分别建立白花鬼针草花粉粗蛋白和纯化蛋白及葎草花粉粗蛋白小鼠过敏性哮喘模型,比较各组之间过敏性哮喘及过敏性鼻炎的症状、气道高反应性、血清特异性IgE、IgG(sIgE、sIgG),脾脏细胞因子白介素4及干扰素Y (IL-4、INF-γ)水平、肺组织和鼻粘膜病理学和组织学改变来评估白花鬼针草花粉的变应原性。结果1.SDS-PAGE结果显示,在120kDa到12.5kDa之间广泛分布了20余条蛋白条带。其中主带7条,其中分子量为12kDa和12.5kDa的条带蛋白含量最多,余下的范围内还还有约10余条次带。2.westen blotting检测发现白花鬼针草花粉变应原的致敏性较强,与花粉过敏患者血清IgE结合能力较大。离子交换层析出6类主要变应原蛋白,其分子质量分别为70kDa、65kDa、54kDa、49kDa、39kDa、33kDa。3、小鼠各动物模型组较空白对照组气道高反应性、血清sIgE、sIgG,脾脏细胞因子IL-4、INF-γ水平均显著增高,各模型组肺组织和鼻粘膜石蜡切片苏木精-伊红染色(H＆E)示其较空白对照组炎症改变明显,且百花鬼针草花粉粗蛋白及纯化蛋白致敏组较葎草花粉粗蛋白致敏组各项指标无明显差异p0.05。结论白花鬼针草花粉变应原有较强的致敏性,其花粉粗提液和纯化变应原均能成功建立小鼠过敏性哮喘及鼻炎模型。为白花鬼针草花粉过敏性急病的诊断和治疗提供了实验依据。
【学位单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R593.1
【部分图文】：

综合各组小鼠情况评分比较，并行统计学分析ｗ。??（十六）数据统计学分析??计量资料均用＾＋ＳＤ表示，结果采用ＳＰＳＳ统计软件进行单因素方差分析，??各均数间两两比较时采用ｔ检验，Ｐ〈０．?０５差异有统计学意义，Ｐ〈０．?０１为差异有??明显统计学学意义，Ｐ＞〇．?０５差异无统计学意义。??实验结果??一、白花鬼针草花朵及花粉观察??左侧为花期中的白花鬼针草，右侧为１００Ｘ光学显微镜下碱性复红染色后的?＊??白花鬼针草花粉，新鲜的花粉粒呈球状，表面有毛刺样凸起，伴有新鲜脂质沉积??于花粉粒表面。??

、白花鬼针草花粉变应原离子交换层祈??将已用ＤＥ－５２离子交换层析缓冲液充分透析白花鬼针草花粉粗提液上柱。??结果显示粗提液有６个主蛋白峰，如下图所示（图３）。??？Ｍｔ??ｍ??ｍ??ＭＭ?ｍ￥?ｗ?ｔｖ？?ｍ??图３白花鬼针草花粉离子交换层析图??注：１－６分别为白花鬼针草的纯化蛋白峰??四、白花鬼针草巧紛粗提液及纯化液ＳＤＳ－ＰＡ化及ＷＢ检测??集各峰的样品进斤Ｓ胳－ＰＡＧＥ，结果如图４．?１。分析表明，离子交换层析后??蛋白主要分布在２峰、３峰、４峰。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示主要变应原组分??在第在１到６峰中均有分布，与患者血清结合阳性条带约６条，分子量分别为??１５??

阴性对照组结果示：在?３、４?峰?７０?ｋＤａ??带处有弱显色（图４．?３），结果表明白花鬼针草花粉粗提液及纯化蛋白均具有较强??的致敏性，其中纯化蛋白２－４峰免疫原性较接近。??ｋＤａ?Ｍ?１?２?３?４?５?６?Ｍ?ＣＰ??麵誦??斯幽瞧帽??１５?户潘?‘＊‘；、．襄讀??化?：遊與扣？?／．?‘泉＇獨??图４．１白花鬼针草花粉粗提液离子交换层析后各峰液的甜Ｓ－ＰＡＧＥ??注：Ｍ：为ｍａｋｅｒ，?１－６分别为离子交换层祈的６峰蛋白，ＧＰ为白花鬼针草花粉粗提液??ｋＤａ?Ｍ?１?２?３?４?５?６?Ｍ?ＣＰ??？?Ｖ?■’與叫．Ｓ皆Ｉ．巧．??图４．?２白花鬼针草花粉粗蛋白和离子交换层析蛋白ＷＢ结果??注：Ｍ：为ｍａｋｅｒ，１－６分别为离子交换层析的６峰蛋白，ＣＰ为白花鬼针草花紛粗提液??１６??
【参考文献】

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本文编号：2836269