IER3IP1在胰岛Beta细胞中的作用初探

发布时间：2020-10-13 07:45

　　 目的最新调查数据显示,目前全世界糖尿病的患病率为9.1%,患病人数已达4.51亿,我国成人糖尿病患病率为10.9%,糖尿病患者达1.48亿。而在所有糖尿病患者中约有1%-5%是由单基因突变引起,被称为单基因突变糖尿病。其中钾内流通道亚家族成员11 J(KCNJ11)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)两个单基因糖尿病基因已经发展成治疗T2D的主要药物靶点。因此,单基因糖尿病是宝贵的“人体疾病模型”,有助于我们了解常见的T1D和T2D的病理生理基础,并为新药物靶点的发现提供可能。最近,有学者报告一种新的综合征,该综合征主要临床表现包括脑回简化的小头畸形,癫痫和永久性新生儿糖尿病,英文全称为Microcephaly-Epilepsy and Neonatal Diabetes Syndrome,简称为MEDS。基因检测显示MEDS主要是由于IER3IP1基因突变造成。本研究旨在探讨IER3IP1蛋白特性,并在分子水平,细胞水平,动物水平研究该蛋白在β细胞合成分泌胰岛素过程中的作用,进一步加深了解MEDS发病机制。方法1、通过免疫荧光研究IER3IP1在INS1细胞中的定位,通过CRISPR/Cas9技术构建IER3IP1-/-敲除的293T细胞系(293T~(IER3IP1-/-)),在293T~(IER3IP1-/-)细胞系中通过加/不加DTT(DTT为一种还原剂,可以打开胰岛素内部的二硫键,破坏原有构象,通过加用和不加用相比,可以判断是否存在错误折叠)处理应用蛋白杂交实验(Western Blotting,WB)分析IER3IP1敲除及突变后对胰岛素原合成、折叠、分泌的影响,并给予β细胞系、小鼠胰岛糖刺激,观察IER3IP1蛋白的表达变化。2、构建IER3IP1-/-动物模型,观察IER3IP1-/-小鼠体重、血糖变化情况,摘取不同时期IER3IP1-/-小鼠胰腺,进行HE染色,统计胰岛占胰腺面积比值变化情况;进行免疫组化及免疫荧光染色,观察胰岛素原、胰岛素含量及定位变化,胰岛α、β、δ细胞分布改变;进行电镜扫描,观察细胞器结构变化;结果1、在INS1细胞中的研究结果表明IER3IP1蛋白既定位于内质网又定位于高尔基体,人体胰腺标本的免疫荧光结果与INS1细胞系中的结果一致;应用蛋白质构象模拟软件预测IER3IP1为N端和C端各一α螺旋结构的蛋白,V12G(M1)突变和L78P(M2)突变分别影响了N端和C端的α螺旋结构;正常情况下IER3IP1蛋白不分泌至细胞外,突变后同样不分泌至细胞外;高糖刺激(25.5mmol/L)会上调IER3IP1表达。2、在293T细胞中研究表明,与过表达IER3IP1蛋白相比,表达M1突变型IER3IP1蛋白,可使细胞分泌效率降低21.1%,表达M2突变型IER3IP1蛋白,可降低细胞分泌降低91.6%;应用同位素示踪法研究发现过表达IER3IP1会增强细胞分泌新合成胰岛素能力,与过表达IER3IP1蛋白相比,表达M1突变型IER3IP1蛋白,可使细胞分泌降低降低37.1%,表达M2突变型IER3IP1蛋白,可降低细胞分泌效率45.7%;应用shRNA敲降IER3IP1蛋白,敲降效率为62.9%时,可使细胞分泌效率下降55%,敲降效率为78.5%时,可使细胞分泌效率下降86.6%;293T ~(IER3IP1-/-)细胞系实验也证实IER3IP1敲除后细胞分泌胰岛素原功能显著下降。3、与C57BL/6小鼠相比,3周龄IER3IP1-/-小鼠空腹血糖正常(6.1mmol/L VS 6.3mmol/L),体重基本正常(6.5g VS 6.03g),胰岛大小、形态正常,但胰岛占胰腺面积下降约13.6%(14.25‰VS 12.31‰);4周龄IER3IP1-/-小鼠出现明显空腹血糖升高(8.4mmol/L VS 19.2mmol/L),体重增加减慢(10.1g VS 8.9g);8周龄IER3IP1-/-小鼠,空腹血糖显著增高(7.6mmol/L VS 22.4mmol/L),体重明显减低(19.4g VS 15.5g),胰岛占胰腺面积下降90.2%(3.656‰VS 0.358‰)。4、发病IER3IP1-/-小鼠胰腺HE染色结果表明,与正常C57BL/6小鼠胰岛细胞排列整齐、规则,细胞核呈(类)圆形,大小较均一,多数呈浅着色,胞浆丰富,胞核居中相比,IER3IP1-/-小鼠胰岛细胞排列不规则,局部呈“拥挤状”,细胞核可见规则圆形,亦可见较多(类)椭圆形,部分细胞胞浆欠丰富,胞核靠近细胞膜;免疫荧光染色发现,与C57BL/6小鼠胰岛胰岛素原聚集在β细胞核周(高尔基体位置)不同,IER3IP1-/-小鼠胰岛β细胞几乎看不到核周的胰岛素原聚集;而且IER3IP1-/-小鼠β细胞胰岛素含量明显减低;电镜扫描显示β细胞内质网变粗,胰岛素分泌颗粒明显减少,并出现大量空泡化线粒体,以及线粒体吞噬囊泡现象;通过WB法检测胰岛相关蛋白表达,结果显示与C57BL/6小鼠相比,IER3IP1-/-小鼠胰岛素表达量降低最高可达93.3%,胰岛素原与胰岛素比值显著增高可达6.34倍;与C57BL/6小鼠相比,4周龄IER3IP1-/-小鼠胰岛p-eIF2α/eIF2α比值降低18.2%,14周龄IER3IP1-/-小鼠胰岛p-eIF2α/eIF2α比值降低42.8%。结论1、本实验成功构建了293T~(IER3IP1-/-)细胞系,成功构建IER3IP1-/-小鼠模型。2、本实验证实IER3IP1蛋白既定位于内质网又定位于高尔基体;IER3IP1蛋白正常情况下和突变后均不分泌至细胞外;高糖刺激可以诱导IER3IP1蛋白表达上调;3、本实验在293T细胞中证实过表达IER3IP1蛋白可以增强细胞分泌功能,敲除或突变IER3IP1蛋白后会抑制细胞分泌功能,增加胰岛素原的错误折叠;4、本实验证实IER3IP1-/-小鼠3周时出现β细胞功能障碍,4周时出现显著高血糖,发病的IER3IP1-/-小鼠β细胞合成胰岛素下降,胰岛素原错误折叠增加,胰岛素原不能正常向高尔基体转运,且出现内质网变粗,大量线粒体空泡化及线粒体吞噬囊泡现象。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

-DIER3IP1蛋白在细胞内的定位

我们在 INS1 细胞系中通过免疫荧光法单通道染色 IER3IP1 蛋白，发现IER3IP1 蛋白呈弥散状分布在细胞浆中，在核周存在高荧光信号（如图 1A 所示）。为进一步明确 IER3IP1 蛋白具体的细胞器定位，我们对 IER3IP1 蛋白与 PDI（内质网 marker），GM130（高尔基体 marker）分别双染。如图 1B 所示，红光代表IER3IP1 蛋白，绿光代表 PDI，二者融合后呈黄色，提示 IER3IP1 蛋白定位于内质网。如图 1C 所示，红光代表 IER3IP1 蛋白，绿光代表 GM130，二者融合后也呈黄色，这提示 IER3IP1 蛋白也定位于高尔基体。我们还在人胰腺中进行了IER3IP1 蛋白的单通道染色，结果如图 1D 所示，与在 INS1 细胞中类似，IER3IP1蛋白在细胞部分区域内呈弥散状分布，在核周可见高荧光信号浓集区。2.2 高糖刺激对 IER3IP1 蛋白表达影响我们以 2.5mmol/L 低糖培养做为对照，观察了 25.5mmol/L 高糖刺激 INS1细胞对 IER3IP1 蛋白表达影响，刺激时间为 6 小时，结果如图 2A-B 所示，与低糖刺激相比，25.5mmol/L 高糖刺激可以诱导 IER3IP1 表达上调约 29.4%。我们在胰岛原代细胞中也进行了同样的糖刺激实验，结果与 INS1 细胞系一致。

M1 突变型、M2 突变型 IER3IP1 蛋白的高级构象，如图 3A-C 所示，图 A 为野生型 IER3IP1 蛋白构象预测，N 端和 C 端各为一 α 螺旋结构，中间为一β折叠的链状结构连接；M1 突变后造成 N 端α螺旋结构破坏；M2 突变后造成了 C 端α螺旋结构被破坏。我们在 293T 细胞中观察了内源性及外源性 IER3IP1 蛋白表达及分泌情况，如图 4 所示，293T 不给予任何处理、转染胰岛素原和空载体时，上清液（medium）中几乎检测不到 IER3IP1 蛋白（medium 中的少许考虑为旁逸），结果提示生理情况下，IER3IP1 蛋白不分泌至细胞外，给予 293T 细胞转染外源性野生型IER3IP1 质粒和胰岛素原时，上清液中同样未检测到 IER3IP1 蛋白，由于转染的IER3IP1 质粒带有一 his-tag 标签，因此较内源性 IER3IP1 蛋白分子量增加，故在WB 检测结果中略高于内源性 IER3IP1 蛋白条带。转染野生型 IER3IP1 质粒及胰岛素原后，内源性与外源性 IER3IP1 蛋白均不分泌至细胞外（上清液中未检测到），同理，在 293T 细胞中转染 M1 突变型质粒+胰岛素原质粒和 M2 突变型质粒+胰岛素原后，上清液中均未检测内源性或外源性 IER3IP1 蛋白突变后，这表明 M1 突变和 M2 突变都没有造成 IER3IP1 分泌至细胞外。
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本文编号：2838918