骨质疏松症患者血浆外泌体microRNA标志物的筛选

发布时间：2020-10-14 17:31

　　 目的:筛选出反映骨质疏松症(osteoporosis,OP)发生发展的血浆外泌体(exosomes)microRNA的标志物,作为早期预测骨质疏松症的实验室检查手段之一,为临床医生提供骨质疏松症诊断及防治的新思路。方法:收集西安市中心医院内分泌科2016年1月至2017年10月门诊及住院患者为研究对象,排除以下情况:内分泌及代谢性疾病、自身免疫性疾病、长期服用影响骨代谢的药物者、胃肠道手术史、肝肾功能不全、恶性血液疾病、遗传性疾病、孕妇、准备妊娠、哺乳期妇女、血压控制不良、严重心脏病、慢性缺氧性疾病、应激情况、全身一般状况较差、年龄40岁及76岁以上。骨质疏松症的诊断标准采用2011年中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志发布的《原发性骨质疏松症诊疗指南(2011)》实行:骨质疏松症:T值≤-2.5;骨量减少:-2.5T值-1;正常骨量:T值≥-1。筛选出原发性骨质疏松症患者、低骨量患者及正常体检人员共24例,其中骨质疏松症组(A组,包括严重骨质疏松症)患者6例,骨量减少组(B组)患者10例,正常对照组(C组)8例,根据腰椎正位及股骨颈双能X线骨密度检查分组,记录所有可纳入本实验的受试者的年龄、性别(女性还需记录绝经年龄)、个人史、用药史,测量其身高、体重、收缩压及舒张压,计算BMI=体重/身高~2(kg/m~2),并签署知情同意书。检测所有受试者的电解质(包括血钙、血磷)、肝功(包括碱性磷酸酶ALP)、肾功、血糖、血脂、甲状腺功能(FT3、FT4、TT3、TT4、TSH)及甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、甲状腺球蛋白抗体(TgAb)、雌二醇(E2)、甲状旁腺素(PTH)、25(OH)D3、铁蛋白(SF)等指标。每组选取3名受试者血浆,应用Ribo exosome Isolation reagent试剂提取血浆外泌体,进一步提取microRNA后运用ND-1000 Nanodrop和Agilent 2200 TapeStation程序对样品进行质检,构建文库后进行测序。分别使用log_2Ratio及散点图比较共同表达的microRNA及其表达量的差异,采用edgeR程序来分析各组间microRNA的差异及其显著性,并计算出P值。运用Pearson相关系数r来分析组间的相关性,明确测序结果的可靠程度。进一步筛选出差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨质疏松症有关的miRNAs标志物。结果:1.A组与C组差异及分析:检测出A组与C组有表达的miRNA共514个,其中有高显著差异的miRNA共316个,有一般显著差异的miRNA共60个。筛选出A组与C组差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨质疏松症有关的miRNA共37个,其中上调的miRNA共17个,下调的miRNA共20个。2.B组与C组间的差异及分析:检测出B组与C组有表达的miRNA共735个,其中有高显著差异的miRNA共60个,有一般显著差异的miRNA共44个。筛选出B组与C组差异倍数较大、表达量较高、既往文献中已证实与骨量减少及骨质疏松症有关的miRNA共34个,其中上调的miRNA共28个,下调的miRNA共6个。3.A组与B组间的关系:检测出A组与B组共同表达的miRNA为372个,其中均与C组有差异的基因共有39个,表达量较高且有显著性差异的miRNA共5个。结论:1.骨质疏松症患者与正常人群相比,的确存在差异表达的miRNAs。2.检测出的71个高表达量的miRNAs与成骨细胞及破骨细胞有着密不可分的关系,且A组与B组中均与C组有差异的miRNA共有39个,表达量较高且有显著性差异的miRNA共5个。这些miRNAs很可能成为骨质疏松症及骨量减少的潜在分子标志物。但由于样本量偏少,且miRNA本身就存在个体差异,所以还需扩大样本量进行进一步的后期重复验证,验证方法采用荧光定量PCR,以精简及完善骨质疏松症的microRNA表达谱。3.A、B、C三组样本相互之间的表达模式均呈正相关,且均为高相关程度,这说明检测出的microRNAs与骨质疏松症的发生发展有着密切的关系。4.通过对本研究筛选出的血浆外泌体microRNA进行检测,可以及时预测骨质疏松症的发生,进而减少脆性骨折的风险,对骨质疏松症的早期诊断有着重要意义。
【学位单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：

表 2-1 A 组与 C 组间 miRNA 差异表达统计计tistical counting of miRNA differential expression between分类 计数（个）|log2(foldchange)|①≥1 5140.01≤P 值＜0.05 60P 值＜0.01 316nge)：以 2 为底，对数化的表达差异倍数。|log2(foldchange)|≥1| ≥1 且 P 值< 0.05，则为一般显著差异；若 |log2(Fold Change)| ≥C 组间 的 miRNA 表达差异如图 2-1 所示，两了所有 miRNA 表达差异，以 |log2(Fold Chang表达下调，灰色点表示 miRNA 表达没有变化，

A 组 C 组图 2-2 A 组与 C 组间 miRNA 表达聚类分析图The cluster analysis of miRNA between group Aand g间相关性分析关系数 r 来分析两组间的变量关系，|r| 越，证明该测序结果的可靠性较高。r 为正值值则代表两组样本呈负相关。其标准为：|r|相关程度普通；0.5≤|r|< 0.7 表示相关程度显|r|<1.0 表示相关程度极高。通过 Pearson 相相关系数 r=0.737，呈正相关，且相关程度

图 2-3 A 组与 C 组间 Pearson 相关系数图. 2-3 Pearson Correlation Coefficient between group Aand grou C 组间的差异及分析 C 组间的 miRNA 差异表达统计计数组与 C 组有表达的 miRNA 共 735 个，其中有 个，有一般显著差异的 miRNA 共 44 个。见表 表 2-3 B 组与 C 组间 miRNA 差异表达统计计数tical counting of miRNA differential expression between group B分类 计数（个）|log2(foldchange)|①≥1 7350.01≤P 值< 0.05 44P 值< 0.01 60
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 唐慧;伍海姗;杨怡;赵靖平;陈晋东;;外泌体源性microRNA在疾病诊疗中的研究进展[J];中南大学学报(医学版);2015年11期

本文编号：2840968