基于GLUT-4分子结构及膜转位功能探索冠心丹参滴丸改善胰岛素抵抗的机制研究

发布时间：2020-10-16 19:51

　　 目的 本研究通过用冠心丹参滴丸观察其对2型糖尿病HOMA-IR等生化代谢指标以及骨骼肌和心肌细胞葡萄糖转运体(GLUT-4)表达和膜转位的影响,通过GLUT-4分子角度探讨冠心丹参滴丸改善胰岛素抵抗的作用及机制。方法 建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型,给予冠心丹参滴丸干预,研究磷酸肌醇3激酶(PI3K)信号通路中骨骼肌和心肌细胞GLUT-4表达、膜转位的变化;体外研究采用棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的大鼠L6细胞IR模型,给予冠心丹参滴丸干预,研究其对骨骼肌和心肌IR模型GLUT-4 mRNA表达、胞膜转位的影响。体外研究采用骨骼肌成肌细胞L6作为研究对象,采用MTT法检测冠心丹参滴丸对骨骼肌细胞活力的影响,确定冠心丹参滴丸作用于体外细胞培养的适宜浓度;采用棕榈酸诱导大鼠L6细胞,建立胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型;冠心丹参滴丸干预细胞后,采用葡萄糖氧化酶法(GOP-POD)检测上清液的葡萄糖浓度,研究冠心丹参滴丸对胰岛素抵抗细胞糖摄取的影响;采用酶法检测细胞内甘油三酯和游离脂肪酸的浓度,研究冠心丹参滴丸对胰岛素抵抗细胞脂质沉积的影响;采用Western Blot法检测冠心丹参滴丸对胰岛素抵抗GLUT-4蛋白表达的影响。动物实验以糖尿病大鼠为研究对象,冠心丹参滴丸干预后,大鼠处死,保存大鼠静脉血,静脉血离心后检测血清胰岛素、胆固醇、葡萄糖、甘油三酯、糖化血红蛋白生化指标,研究冠心丹参滴丸对糖尿病大鼠胰岛素抵抗相关指标的影响;用免疫组化的方法观察GLUT-4在骨骼肌和心肌组织中的定位并测定其光密度值以表示蛋白量探讨冠心丹参滴丸改善胰岛素抵抗的机制。结果 通过建立胰岛素抵抗模型,研究冠心丹参滴丸对于细胞或动物模型的作用效果;通过体外培养骨骼肌细胞,建立胰岛素抵抗模型;细胞实验研究了冠心丹参滴丸对于细胞IR模型的作用效果,通过体外培养骨骼肌细胞,棕榈酸诱导L6细胞胰岛素抵抗,冠心丹参滴丸干预后,L6细胞对葡萄糖的摄取明显增加,改善了PA诱导的L6细胞胰岛素抵抗程度;冠心丹参滴丸干预后,L6细胞内甘油三酯、游离脂肪酸的含量降低,减少了PA诱导的L6细胞脂质沉积;通过建立糖尿病动物模型,得到相似的结论,并得出了冠心丹参滴丸具有降低血糖,改善血脂代谢的结果;通过免疫组织化学的方法进一步证实了冠心丹参滴丸改善了GLUT-4在骨骼肌、心肌组织中的表达,表明了冠心丹参滴丸具有通过GLUT-4通路改善机体胰岛素抵抗的功效,GLUT-4广泛存在于胰岛素敏感的骨骼肌,其介导的葡萄糖转运在糖稳态调控中发挥着重要作用。冠心丹参滴丸干预后,增加了GLUT-4的表达,从而促进葡萄糖的摄取,改善胰岛素抵抗。结论 冠心丹参滴丸通过干预胰岛素抵抗中的一些关键因素,促进GLUT-4转位,增加GLUT-4的表达,初步验证了冠心丹参滴丸对于胰岛素抵抗具有一定的作用效果,从而增加机体胰岛素敏感性,具有改善血糖以及降低血脂的效果。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文于一个稳定状态。当人体胰岛素下降时，细胞表面 GLUT-4 能够恢复到初始状态下的水平。GLUT-4 在机体糖稳态调控过程中发挥着重要作用，在 2 型糖尿病患者的相关肌组织（以骨骼肌、心肌等为主）中，能够看到此蛋白表达呈下降趋势[8]。在小鼠模型中，GLUT-4 蛋白表达水平降低使小鼠产生胰岛素抵抗和糖尿病。GLUT-4 在肌肉组织和脂肪组织中过量表达可以改善小鼠的血糖控制和糖耐受不良[9, 10]。

天津医科大学硕士学位论文关研究人员在胰岛素抵抗和糖尿病中发现了 AKT2 突变。AS160（TBC1D4，分子量 160kD）是 AKT2 的一个重要底物，敲除 AS160 和其类似功能蛋白 TBC1D1，可显著减少胰岛素刺激的葡萄糖运输[11]。AS160 含有一个 GTP 酶激活蛋白（GAP）结构域，其能特异地作用于 G 蛋白 Rab。Rab 是一类能促进囊泡运输的GTP 结合蛋白，通过与 GDP 结合的状态来进行转化，通常是从失活到活化的一个转化，该过程能够发生系列催化反应来改变膜运输量。AS160 在基础状态下处于去磷酸化状态，能通过 GTP 酶将 GTP 转化成 GDP[12]。这使 Rab 蛋白处于失活状态，从而抑制了 GLUT-4 囊泡在细胞内的运输。在胰岛素刺激下，AS160的氨基酸残基被 AKT2 磷酸化后无法进行 GAP 表达[13]，使 Rab 蛋白可以与 GTP结合，促进 GLUT-4 囊泡运输同时敲低 Rabl0 则会减弱基础状态时由于 AS160缺失所引起的表面 GLUT-4 增多现象。另外，文献报道的 AS160 的下游 Rab 蛋白除 Rabl0 外，还有 Rab8、Rabl3 和 Rabl4 等[14]。

抑制率可达 24.9％，其细胞毒性显著强于对照组（P＜0.05，图 3），根据实验结果，选取作用于 L6 细胞的适宜浓度范围是 0.2-0.8 g/L。图3 不同浓度冠心丹参滴丸干预 24 h后对L6细胞存活率的影响（与空白对照组比较，* P ＜0.05）1.2.2 胰岛素抵抗骨骼肌细胞模型的建立
【参考文献】

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本文编号：2843699