采用高通量测序筛选MC4R下游基因表达谱及验证

发布时间：2020-10-17 00:24

　　 背景肥胖是一种以身体脂肪含量过多和/或分布异常,常伴有体质量增加为重要特征的多病因慢性病。近年来,随着生活水平的提高,肥胖人群逐年增长,肥胖症已成为世界范围的流行病。最新肥胖流行病学研究显示,全球男性和女性肥胖人口分别增长至2.66亿和3.75亿,而中国的肥胖人群数目已近9000万,位居世界首位。同时,肥胖可导致高胰岛素血症,二者互为因果,形成恶性循环。虽然科学界在19世纪就已提出脑组织在葡萄糖稳态中起主导作用,但随着胰岛素的发现,整个20世纪国内外研究主要集中于胰岛在维持血糖稳态中的作用,掩盖了脑作为关键点调控血糖稳态的地位。国外研究显示,将对外周组织无任何影响的低剂量瘦素直接注射入胰岛素缺乏动物的脑室中,发现中枢瘦素仍可使糖尿病动物模型的血糖正常化。这惊人的结论与以胰岛为中心的葡萄糖稳态模式不符。提示我们,外周能量代谢及葡萄糖稳态的维持除了直接受到外周代谢器官的影响外,中枢神经系统及中枢能量调控因子发挥的作用也不容小觑。下丘脑黑皮质素受体4(MC4R)属于七次跨膜的G蛋白偶联受体,是中枢黑皮质素通路的重要组成部分。MC4R通过与其内源性激动剂α-促黑素细胞激素(α-MSH)及内源性拮抗剂刺鼠相关蛋白(AgRP)相互作用而发挥调节食欲和能量代谢的作用。已有研究指出,MC4R是哺乳动物能量稳态和体重的关键调节子,能够感知和整合外界刺激信号,调节食欲、自主神经及神经内分泌系统的活性从而控制能量代谢。而MC4R杂合突变是人类单基因肥胖最常见的病因。且本课题组前期研究表明,大脑MC4R的活化可改善糖尿病动物模型中骨骼肌线粒体的功能损伤,纠正线粒体氧化应激。另有研究指出,敲除MC4R的大鼠表现出血清脂类浓度明显升高、内脏白色脂肪组织重量增加、脂肪细胞数量增多以及糖耐量受损。综上,脑部MC4R在外周能量代谢中发挥至关重要作用。然而,MC4R仅仅为中枢神经系统中神经元表面的跨膜受体,无法直接作用于外周。因此,我们推测,MC4R对外周代谢器官的影响可能借助于某些中间介质而发挥调控作用。高通量测序技术,又称为第二代测序技术,以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。其中,转录组测序可检测特定细胞在某一功能状态下所能转录出的所有mRNA的总和。可以整体水平研究基因功能及基因结构,发现不同生理或者病理状态下细胞、组织或个体内差异表达的基因。因此,我们拟通过高通量测序技术筛选MC4R过表达细胞中差异表达的mRNAs,并进行生物信息学分析及初步机制探索,为下一步深入研究中枢MC4R与外周代谢器官的能量消耗及糖代谢的具体机制奠定基础。目的本研究拟构建MC4R过表达腺病毒载体并转染小鼠下丘脑GnRH神经元细胞(GT1-7细胞),采用高通量测序技术,筛选MC4R下游差异表达基因。并使用实时荧光定量PCR、Western Blot对部分差异表达mRNAs进行验证,初步探讨MC4R影响外周能量代谢及胰岛素敏感性的新靶点,以期有利于探寻与肥胖相关的以脑为中心的新的代谢通路,为靶向纠正肥胖及胰岛素抵抗相关疾病奠定坚实的理论基础。方法培养小鼠下丘脑GnRH神经元细胞(GT1-7细胞)。构建MC4R过表达腺病毒载体,并转染小鼠下丘脑GT1-7细胞。采用高通量测序技术,检测MC4R过表达组(n=3)与对照组(n=3)GT1-7细胞内差异表达的mRNAs,构建差异表达谱。对差异mRNAs进行GO分析、KEGG Pathway分析,筛选出能量代谢、内分泌及代谢疾病等代谢通路及相关差异表达mRNAs。此外,构建MC4R过表达、干扰表达腺病毒载体,并转染小鼠下丘脑GT1-7细胞。采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法验证MC4R过表达组、MC4R干扰组及对照组中MC4R与筛选出的部分差异基因的表达情况,并对MC4R通过何种下游通路调控外周能量代谢的机制进行初步探讨。结果1.高通量测序结果显示,MC4R过表达组GT1-7细胞与对照组GT1-7细胞相比,表达变化的mRNAs共有近千条。其中表达上调的mRNAs有629条,表达下调的mRNAs有260条,且变化倍数均大于2倍(Q0.001)。2.对差异表达的mRNAs进行GO分析显示,生物学过程主要集中在生物学调节、细胞过程、细胞成分组织或生物发生、发育过程、代谢过程、刺激反应、信号通路等过程;分子功能主要集中在分子结合、催化活性、转录调节子活性、转运蛋白活性、信号转导蛋白活性、分子功能调节因子等方面。KEGG Pathway分析显示,基因调控主要集中在内分泌和代谢疾病、环境适应性调节、感染性疾病、能量代谢、脂质代谢、聚糖合成及代谢、cAMP通路、钙信号通路、cGMP-PKG通路、细胞转运和分解等代谢途径。3.实时荧光定量PCR及Western Blot验证部分差异表达的mRNAs,结果显示:MC4R过表达组中MC4R、ADCY3、AGT mRNA及蛋白均表达上调,MC4R干扰组则相反。而与ADCY3、AGT的表达情况相反,MC4R过表达组的HCRT mRNA及蛋白均表达下调,MC4R干扰组的HCRT mRNA及蛋白均表达升高。结论1.在MC4R过表达的下丘脑GT1-7细胞中,涉及内分泌和代谢疾病、环境适应性调节、能量代谢、信号转导等通路的基因表达谱发生了显著变化。2.下丘脑GT1-7细胞中MC4R受到活化后可增加下游ADCY3、AGT分子的表达,从而直接或间接发挥能量调节作用。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

图 1.1 pDC316-mCMV-EGFP 载体质粒图.2.2 目的基因的准备1) 引物设计C316-MC4R-F：CGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCATGAACTCCACCACCATC316-MC4R-R：GCTGATCAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTAATACCTGCAAC2) MC4R 基因MC4R 基因合成于苏州金维智生物技术有限公司，将其连接在已制备的 pDC316-mCMV-EGFP 上，连接的酶切位点分别是 Not I 和 Hind III。3) PCR 反应扩增目的基因以合成的 MC4R 基因为模板，进行 PCR 反应扩增，扩增体系如下：

图 1.2 mRNA 文库构建流程图分析流程的数据称为 raw reads 或 raw data，随后要对 raw r测序数据是否适用于后续分析。质控后，经过滤得到列。比对完，通过统计比对率、reads 在参考序列上的是否通过第二次质控(QC of alignment)。若通过，则因表达水平的各项分析（主成分、相关性、差异基因样品间差异表达基因，进行 GO 功能显著性富集分析、聚类、蛋白互作网络和转录因子等更深入的挖掘分

15图 1.3 信息分析流程图.4 数据过滤测序的原始数据包含低质量、接头污染以及未知碱基 N 含量过高的 re分析之前需要去除这些 reads 以保证结果的可靠性。过滤后 reads 的质过滤后 reads 质量统计表，原始数据过滤成分统计图，碱基含量分布以布见 Clean reads 碱基含量分布图和 Clean reads 的碱基质量分布图。本软件 SOAPnuke 进行过滤，具体步骤如下：1) 去除包含接头的 reads（接头污染）；2) 去除未知碱基 N 含量大于 5%的 reads；3) 去除低质量的 reads (我们定义质量值低于 10 的碱基占该 reads 总碱例大于 20%的 reads 为低质量的 reads)。
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本文编号：2843998