环状RNA作为系统性红斑狼疮的生物标志物的筛选研究与鉴定

发布时间：2020-10-17 01:02

　　 研究背景系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种在黄种人群中高发的典型自身免疫性疾病之一,通常情况下,患者的免疫细胞异常活化,产生大量自身抗体与免疫复合物,各种细胞免疫应答功能紊乱,最终导致全身多器官系统受损。SLE的的症状多种多样,主要累及皮肤黏膜、肾、血液系统、关节和神经等多种器官。以往的研究多偏向于SLE与遗传,表观遗传等基因组学研究,然而目前研究结果揭示SLE的发生、发展、转化与非编码RNA(包括IncRNA和miRNA等)有显著的相关性,环状RNA也是非编码RNA家族中的一员,虽然它早就被发现,但是一直没有被真正深入的研究,近年来,它因自身的一系列突出特点——如半衰期长、组织特异性明显等成为近年来的明星分子,但是SLE与环状RNA的关联仅有寥寥数篇文章,且缺乏第三代测序技术(RNA-seq)在SLE患者与正常人PBMCs中的研究。目的借助RNA-seq技术了解环状RNA在SLE患者与正常人PBMCs中的表达情况,初步筛选可能作为红斑狼疮生物标志物的分子,并进行验证实验。选其中数据最良好的一个(circ-PTPN22)初步探讨其可能的作用机制。方法本课题采用病例对照设计,收集未经过治疗的新发SLE患者4例,和3例健康对照,利用RNA-seq技术初步筛选出128种差异化表达的circRNA(log2FC≥1.0),选取其中2种上调circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1)和2种下调circRNA(circ-PTPN22、circ-MYBL1)做大样本量RT-qPCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)验证(49例SLE患者与37例健康对照),再选取差异较为明显的circRNA-circPTPN22做进一步分析(桑格测序,SLEDAI指数相关性,治疗前后对比,ROC曲线等),并预测circPTPN22可能的生物学功能,如靶向miRNA结合功能,ORF框预测,IRES结合位点预测,可能翻译的蛋白质序列预测等。随即用分子生物学技术构建过表达circPTPN22的载体质粒,将质粒电穿孔转染jurkat细胞,用免疫印迹试验(western blot,WB)证实了其能够翻译蛋白质,并预测了circPTPN22及其翻译的小蛋白可能的功能作用。结果本研究借助RNA-seq技术初步筛选出128个在SLE患者和健康对照组PBMCs中差异表达的环状RNA(log2FC≥1.0),包括89种上调circRNA与39种下调circRNA,部分测出的circRNA未被circbase网站收录。筛选出的4种circRNA(circ-LRRK2、circ-PPHLN1、circ-PTPN22、circ-MYBL1)的RT-qPCR趋势均与RNA-seq结果相符。Circ-PTPN22进一步分析提示,circPTPN22与病人的SLEDAI指数呈明显的负相关性,即病人的SLEDAI评分越高,circPTPN22的表达越低。在病人治疗前后的对比中,治疗后的病人circPTPN22的表达较治疗前明显上升。ROC曲线图提示circPTPN22的曲线下面积(AUC)为0.918,提示circPTPN22具有较好的诊断价值。进一步生物学分析表明,circPTPN22可结合多种miRNA,这些miRNA的靶基因,如CD28,IL7等多与免疫调节相关。此外,circPTPN22还具有IRES位点以及多个ORF框,预测具有蛋白质翻译活性。构建过表达circPTPN22载体,电转染jurkat细胞,WB结果显示,circPTPN22的确能翻译出蛋白质。结论本次研究发现了128个在健康人与初发SLE患者PBMCs内差异表达的circRNA,证实了circPTPN22、circMYBL1在SLE患者体内表达较低,circ-LRRK2、circ-PPHLN1在SLE患者体内表达升高。证明了circPTPN22的确存在,并具有优良的SLE病情判断能力,有望成为新的SLE活动标志物。证实了circPTPN22确实可以翻译蛋白质(circPTPN22-pro)。并进一步预测了circPTPN22和新蛋白circPTPN22-pro的功能作用。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.241
【部分图文】：

28 SLE 患者和健康对组 circRNA 表达谱的鉴定形图显示了各个样本归 化（标准化）后近似相等的分布。点图，可将 SLE 组与对照组 circRNA 的表达差异可视化。红色和绿色圆

图 2 SLE 患者与健康对照组间异常环状 rna 的生物信息学分析。(A)128 个差异表达的 circRNA 来源的染色体的位置分布。(B)SLE 组与正常组之间环状 rna-mirna-mrna 网络的 KEGG 通路分析。y 轴代表最显著富集的通路名称，x 轴代表通路的得分(P 值的负对数)。上图为上调的 circRNAs;下图为下调的 circRNAs。Fig. 2. Computational bioinformatics analysis of aberrant circRNAs betweenpatients with SLE and healthy controls.(A) The differentially expressed circRNAs and the distributions of their chromosomallocations. (B) KEGG analysis of the circRNA-miRNA-mRNAs network between theSLE and normal groups. The y-axis represents the most significantly enriched pathways,and the x-axis represents their scores (negative logarithm of P value). Up, upregulatedcircRNAs; down, downregulated circRNAs.

图 3 SLE 患者和正常人 PBMC 中各环状 RNA 的表达情况(A) 49 例 SLE 患者和 37 例健康对照组 pbmc 中 circLRRK2 的表达。(B) 49 例 SLE 患者和 37 例健康对照组 pbmc 中 circPPHLN1 的表达。(C) 49 例 SLE 患者和 37 例健康对照组 pbmc 中 circPTPN22 的表达。(D) 49 例 SLE 患者和 37 例健康对照组 pbmc 中 circMYBL1 的表达。Fig.3 Expression of various circRNAs in PBMC of SLE patients and normal people(A)Expression of circLRRK2 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37 healthycontrols. (B)Expression of circPPHLN1 in PBMCs from 49 patients with SLE and 37healthy controls. (C)Expression of circPTPN22 in PBMCs from 49 patients with SLEand 37 healthy controls. (D)Expression of circMYBL1 in PBMCs from 49 patientswith SLE and 37 healthy controls.
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本文编号：2844039