抗瓜氨酸化蛋白抗体在类风湿关节炎中促炎作用的机制研究

发布时间：2020-10-19 10:38

　　 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见自身免疫性疾病。RA在成年人中发病率约为0.5%-1%,年新发病例5-50例/10万人。RA具有一定遗传倾向,遗传可能性为40-65%。RA临床表现主要是多发性、对称性的关节肿痛、挛缩畸形和功能障碍。除此之外,RA常伴发多脏器系统性病变,对患者生命健康和生活质量有较大威胁。上世纪九十年代后期,研究人员在RA患者血清样本中发现一类新型自身抗体-抗瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibodies,ACPA)。研究发现,该类抗体具有较好RA临床诊断特异性。ACPA的靶抗原是一类发生蛋白翻译后修饰(蛋白瓜氨酸化)而产生的瓜氨酸化抗原。通常,蛋白瓜氨酸化由肽精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)催化实现。初步研究表明,ACPA可加剧RA慢性炎症的持续具有显著的致病作用。ACPA通过刺激单核巨噬细胞产生TNF-α等促炎细胞因子,促进炎性进展。ACPA可协同类风湿因子(rheumatoid factor,RF)加重炎症过程。白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是在先天性免疫应答过程中的关键炎症介质,并在慢性炎症病理进展中有重要作用。IL-1β在RA患者关节滑膜局部聚积,且在RA病情进展的各个阶段均明显升高。IL-1β主要通过炎性小体依赖的途径产生。炎性小体主要由炎性小体传感器分子(如NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族蛋白3(NLRP3)和NOD样受体家族蛋白C4(NLRC4)等),衔接蛋白即凋亡相关斑点样蛋白(ASC)以及胱天蛋白酶1(Caspase 1)组成。在RA研究最常见的类型是NLRP3炎性小体。NLRP3炎性小体在RA中高度表达;RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小体相关基因(ASC,NLRP3-FL,NLRP3-SL和CASP1基因)表达升高。此外,作为RA发病重要危险因素,非受体型酪氨酸蛋白磷酸酶22(tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 22,PTPN 22)可对NLRP3炎性小体活化进行调节。然而,RA患者体内ACPA是否能刺激单核巨噬细胞产生IL-1β目前尚无深入研究。本研究主要分三部分进行。第一部分:ACPA活化巨噬细胞NLRP3炎性小体诱导IL-1β产生。通过对ACPA阳性RA患者,ACPA阴性RA患者和骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者关节滑膜组织免疫组化染色(immunohistochemical staining,IHC staining)发现,ACPA阳性RA组患者IL-1β水平升高。为对该现象在离体水平进行研究,我们使用患者血清纯化的ACPA直接刺激PBMC来源的巨噬细胞并检测培养基中的IL-1β水平。结果表明,ACPA刺激巨噬细胞以时间和剂量依赖性方式产生IL-1β。进一步研究发现,干涉NLRP3分子IL-1β产生减少。该结果表明,ACPA通过活化巨噬细胞NLRP3炎性小体促进IL-1β产生。通过对RA患者滑膜组织中CD147和NLRP3表达水平分析,我们发现在ACPA阳性RA患者中NLRP3和CD147表达均增加且二者表达程度高度正相关。体外实验表明,ACPA刺激慢病毒干涉CD147的巨噬细胞IL-1β产生显著减少。与对照细胞相比,干涉CD147的巨噬细胞在ACPA刺激后Akt和NF-κB信号通路活化水平下降,而JNK信号通路活化水平未发生明显变化。上述结果表明,ACPA在体内和体外均可活化巨噬细胞NLRP3炎性小体诱导IL-1β炎性因子产生;CD147可能参与ACPA对巨噬细胞的活化过程。第二部分:ACPA增强CD147-integrinβ1相互作用,活化下游Akt/NF-κB信号通路。免疫荧光染色实验结果表明CD147和ACPA在细胞表面共定位。Co-IP实验和SPR实验结果提示CD147和ACPA可发生相互作用。应用Co-IP实验进一步研究证实ACPA可增强CD147-integrinβ1相互作用。应用GRGDS阻断CD147-integrinβ1相互作用导致ACPA引起的Akt信号通路活化及pro-IL-1β表达受抑制。应用LY294002抑制Akt信号通路也可得到类似结果,即NLRP3炎性小体表达减少,IL-1β产生减少。该现象表明,ACPA促进CD147-integrinβ1相互作用,并活化下游Akt信号通路,诱导NLRP3炎性小体相关成分表达。免疫荧光定量分析和Western blot实验进一步证实ACPA引起的CD147-integrinβ1相互作用激活Akt信号通路后,导致下游NF-κB信号通路活化,并导致转录因子p65进入细胞核,促进NLRP3分子和pro-IL-1β分子转录。上述结果表明,ACPA可作为诱导剂促进NLRP3炎性小体的表达,为后续激活过程做准备。第三部分:ACPA诱导巨噬细胞释放ATP促进NLRP3炎性小体激活。应用ACPA处理PBMC来源的巨噬细胞,并应用萤光素酶法对细胞培养液中ATP水平进行检测,结果表明ACPA处理使PBMC来源的巨噬细胞培养液中ATP含量升高。干涉CD147或干涉integrinβ1或使用GRGDS阻断二者相互作用均可显著抑制细胞培养液中ATP含量升高。使用丙磺舒抑制Pannexin通道,可明显抑制胞外ATP含量升高和IL-1β的产生。结果提示,胞外ATP含量升高可能是ACPA活化巨噬细胞Pannexin通道引起胞内ATP外流所致。应用oxATP阻断胞外ATP与细胞膜表面P2X7受体结合或应用格列本脲阻断P2X7受体后,胞外ATP仍维持较高水平但IL-1β的产生明显减少。该结果证明,胞外ATP活化NLRP3炎性小体需要P2X7受体参与。上述结果表明,ACPA可通过增强CD147-integrinβ1相互作用而激活Pannexin通道,促进ATP外排;ATP外排至细胞外后与细胞膜表面P2X7受体结合导致细胞内NLRP3炎性小体激活。综上所述,我们首次发现ACPA促进NLRP3炎性小体表达与活化,引起RA患者关节局部IL-1β增加。ACPA处理可增强巨噬细胞CD147-integrinβ1相互作用,激活下游Akt/NF-κB信号通路使NLRP3炎性小体成分表达增加。此外,ACPA激活巨噬细胞Pannexin通道,引起ATP外排。外排至细胞外的ATP与细胞膜表面P2X7受体结合,最终引起NLRP3炎性小体活化。本研究提出了RA中ACPA促进IL-1β产生的机制,明确ACPA在疾病发生中的新作用,提供了RA治疗潜在的新靶点。
【学位单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.22

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 蓝晶晶;吴伟杰;王建中;;西瓜皮中L-瓜氨酸含量测定及提取技术研究[J];黑龙江农业科学;2016年03期

2 魏惠平;王昱;靳佩;王铮;;重症患者血清瓜氨酸水平与胃肠损伤的相关性研究[J];中国医学创新;2016年09期

3 席冬华;李维霞;高晶;阿塔吾拉·铁木尔;李玲;吴斌;;液相色谱-质谱法和高效液相色谱法定性定量测定籽瓜中的L-瓜氨酸[J];食品科学;2014年24期

4 许丽霞;李桂华;张涛;侯雪娇;陈文;;L-瓜氨酸泡腾片的制备及其质量检测[J];食品工业;2015年07期

5 钟兵;方勇飞;;蛋白质瓜氨酸化及其在类风湿关节炎中的意义[J];实用医院临床杂志;2015年05期

6 杨云敏;左方财;;抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体检测对早期类风湿关节炎的诊断价值探讨[J];健康之路;2017年06期

7 李爱峰;柳仁民;张永清;;高效液相色谱-蒸发光散射测定瓜蒌中L-瓜氨酸的含量[J];食品工业科技;2013年03期

8 高德玉;李晓军;武建国;;抗瓜氨酸化蛋白抗体特异性免疫复合物在类风湿关节炎中的作用[J];医学研究生学报;2013年02期

9 宗明;张慧;孙立山;李牛;虞珊珊;范列英;;瓜氨酸化波形蛋白对树突状细胞成熟及功能的影响[J];现代免疫学;2012年02期

10 方佳茂;;一株产L-瓜氨酸微生物菌株的鉴定[J];发酵科技通讯;2010年02期

相关博士学位论文 前10条

1 田昕;瓜氨酸化Ⅱ型胶原及其抗体在类风湿关节炎发病中作用的研究[D];吉林大学;2007年

2 陈华;Sa抗原相关蛋白质的研究[D];中国协和医科大学;2006年

3 阎海娟;中枢神经系统感染和痴呆疾病脑脊液中蛋白组学变化研究[D];天津医科大学;2011年

4 张继冉;酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究[D];江南大学;2016年

5 吴殿辉;代谢工程改造黄酒酿造用酵母低产氨基甲酸乙酯的研究[D];江南大学;2016年

6 蔡彬;瓜氨酸对脓毒症早期大鼠肝损伤的保护作用及其机制研究[D];广西医科大学;2016年

7 李华涛;谷氨酰胺抗鲤鱼红细胞凋亡作用及作用机制研究[D];四川农业大学;2013年

8 郭燕燕;类胰蛋白酶是类风湿关节炎的候选自身抗原[D];第三军医大学;2014年

9 孙玥;类风湿关节炎自身抗原cfb诱导骨髓MSC致炎作用及机制研究[D];南京大学;2015年

10 孙莉萍;汉族人群类风湿关节炎与细胞因子信号转导抑制因子3的研究[D];山东大学;2011年

相关硕士学位论文 前10条

1 肖飞;瓜氨酸对老年脓毒症肠道屏障功能的影响[D];广州中医药大学;2015年

2 董曦文;抗瓜氨酸化蛋白抗体在类风湿关节炎中促炎作用的机制研究[D];中国人民解放军空军军医大学;2018年

3 禹伟;分离自黄酒发酵液的乳酸菌积累和降低瓜氨酸的研究[D];江南大学;2018年

4 周吉秋;瓜氨酸对脓毒症大鼠肠道的保护作用及高迁移率族蛋白B1释放水平的影响[D];广西医科大学;2018年

5 王学超;抗环瓜氨酸肽抗体识别表位谱初步研究[D];天津医科大学;2018年

6 管晓龙;类风湿关节炎血清免疫复合物/滑膜组织抗原的质谱鉴定、差异蛋白分析与瓜氨酸修饰的初步研究[D];江苏大学;2017年

7 方三余;土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）瓜氨酸酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析[D];浙江工业大学;2013年

8 王亚宁;天然L-瓜氨酸的分析及制备研究[D];北京化工大学;2006年

9 刘昕;瓜氨酸生物转化及其分离纯化的研究[D];江南大学;2015年

10 屈冉;聚氨酯固定化粪链球菌制备L-瓜氨酸的研究[D];北京化工大学;2011年

本文编号：2847094