干扰YAP和干扰TAZ表达通过调控细胞自噬抑制RA-FLS的迁移和侵袭

发布时间：2020-10-19 21:11

　　 目的:研究Hippo信号通路下游效应因子YAP/TAZ对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移和侵袭的影响,并初步阐明干扰YAP和干扰TAZ表达是否可能通过调控细胞自噬影响RA-FLS的迁移和侵袭。方法:1、选择生长状态良好的RA-FLS,经FITC标记的鼠抗人CD90抗体和PE标记的鼠抗人CD55抗体孵育后采用流式细胞仪进行鉴定。2、运用 Western Blot 检测 RA-FLS(RA-FLS 组)和正常人 FLS(NC-FLS 组)中 YAP和TAZ的表达情况,并分析两组的表达差异。3、构建干扰YAP和干扰TAZ表达的慢病毒载体,包装慢病毒后感染细胞,进一步使用嘌呤霉素筛选获得稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)、稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)以及空载病毒对照组(sh-C组)的细胞模型,并采用RT-qPCR与Western Blot进行验证。4、利用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的影响。5、通过Western Blot检测干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS中自噬相关蛋白LC3B和p62表达的影响。6、利用细胞免疫荧光染色实验研究干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS中LC3B斑点形成的影响。7、运用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验观察自噬抑制剂CQ、3-MA对干扰YAP和干扰TAZ表达后RA-FLS迁移和侵袭的影响。8、通过Western Blot检测自噬抑制剂CQ、3-MA对干扰YAP和干扰TAZ表达后RA-FLS中LC3B和p62表达的影响。结果:流式细胞仪鉴定MH7A表达CD90和CD55的阳性率为96.7±1.18%(n=3),明确该细胞株为RA-FLS,可用于后期实验。本课题首先采用Western Blot检测RA-FLS和NC-FLS中YAP和TAZ的表达,结果显示,RA-FLS中YAP和TAZ的表达明显升高,提示RA-FLS中YAP和TAZ呈现高表达。其次,构建干扰YAP和干扰TAZ表达的慢病毒载体,包装慢病毒后感染细胞,进一步使用嘌呤霉素筛选获得稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)、稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)以及空载病毒对照组(sh-C组)的细胞模型,并采用RT-q与Western Blot进行验证,结果显示,sh-YAP组RA-FLS中的YAP和sh-TAZ组RA-FLS中TAZ分别在mRNA、蛋白水平上表达明显降低。同时,利用RT-qPCR检测了目前公认的受到YAP/TAZ转录调控的下游靶基因CTGF和CYR61的mRNA水平,结果表明,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中CTGF和CYR61的mRNA表达水平也显著下降。结果提示,细胞模型构建成功,可用于进一步实验。为了研究稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-FLS迁移和侵袭的影响,运用细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验进行观察,细胞划痕实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组划痕愈合明显减慢;Transwell细胞迁移实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS迁移的数目明显减少,与细胞划痕实验结果相符;Transwell细胞侵袭实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS侵袭的数目明显减少。结果提示,干扰YAP和干扰TAZ表达可抑制RA-FLS的迁移和侵袭。进一步研究了稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-FLS自噬的影响,Western Blot实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中LC3B-Ⅱ的表达量明显上升,而p62表达明显下降。细胞免疫荧光染色实验结果显示,sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS中LC3B斑点形成增加。结果表明,干扰YAP和干扰TAZ表达可促RA-FLS的自噬。为了阐明稳定干扰YAP表达(sh-YAP组)和稳定干扰TAZ表达(sh-TAZ组)对RA-迁移和侵袭的影响是否可能通过调控细胞自噬来实现的,进一步探究了自噬抑制剂CQ、3-MA对sh-YAP组和sh-TAZ组RA-FLS的作用,细胞划痕实验、Transwell细胞迁移和袭实验结果显示,与sh-YAP组相比,sh-YAP+CQ组、sh-YAP+3-MA组RA-FLS迁移和侵袭明显增强;与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+CQ组、sh-TAZ+3-MA组RA-FLS迁移和袭也明显增强。Western Blot结果显示,与sh-YAP组相比,sh-YAP+CQ组LC3B-Ⅱ、p62的表达明显升高;与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+CQ组LC3B-Ⅱ、p62的表达明显升高。与sh-YAP组相比,sh-YAP+3-MA组LC3B-Ⅱ表达量稍下降,但p62的表达明显升高。与sh-TAZ组相比,sh-TAZ+3-MA组LC3B-Ⅱ表达也稍下降,但p62的表达也明显升高。果提示,抑制RA-FLS自噬可逆转干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的响。结论:RA-FLS中的YAP和TAZ呈现高表达,干扰YAP和干扰TAZ表达可明显抑制RA-的迁移和侵袭。同时,干扰YAP和干扰TAZ表达能够促进RA-FLS的自噬,抑制RA-FLS的自噬可逆转干扰YAP和干扰TAZ表达对RA-FLS迁移和侵袭的影响。实验结果表明,干扰YAP和干扰TAZ表达可能通过调控细胞自噬抑制RA-FLS的迁移和侵袭。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

选择生长状态良好的ＲＡ－ＦＬＳ?（ＭＨ７Ａ），离心收集细胞后先以异硫氰酸荧光素??（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ?ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）标记的?ＣＤ９０?抗体和藻红蛋白（Ｐ－ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）??标记的ＣＤ５５抗体标记细胞，再通过流式细胞仪检测细胞表面标记物的表达情况，如图１??所示，细胞同时表达ＣＤ５５、ＣＤ９０的阳性率为９６．７土?１．１８％?（ｎ＝３），结果表明此细胞为??ＲＡ－ＦＬＳ，可用于后期实验。??Ａ?＾?＾￣＂?０１－ＵＲ?？?＾?０１－ＵＲ??ｒ：???ｉ＾ｏ；?＾ｉ：?ｉ?－〇；?—??：〇１－ＬＬ＊＇＊?．?：?Ｑ１－ＬＬ??—Ｉ?１１?ＩＲＩ｜?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ｌｌｉｎｆ?■?ｉ?１１?ｉ“ｉ｜?ｉ?ｉ?１１?Ｉ?Ｉ?ｔｉｉｍ｜?ｉ?ｉ?ｕｌｉｉｉｊ?Ｉ?＾?ｌｌｌｉｆｔ｜?ｉ??１０？?１〇４?１Ｃｆ?１０？?１〇Ｐ?１０４?１０？??ＣＤ５Ｓ?ＰＥ－Ａ?ＣＤ５５?ＰＥ－Ａ??图１?ＲＡ－ＦＬＳ的鉴定结果，Ａ为不加抗体的阴性对照，Ｂ为表达ＣＤ５５＋／ＣＤ９０＋的细胞群??Ｆｉｇ．?１?Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?ＲＡ－ＦＬＳ，?Ａ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ?ｇｒｏｕｐ?ｉｎｃｕｂａｔｅｄ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ａｎｔｉｂｏｄｙｓ，?Ｂ??ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｇｒｏｕｐ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＣＤ５５＋／ＣＤ９０＋??３．２?ＲＡ－ＦＬＳ中的ＹＡＰ和ＴＡＺ表达升髙??本课题前期工作结合基因芯片技术和ＲＴ－ｑＰＣＲ验证结果发现，与正常人ＦＬＳ（ＮＣ－ＦＬＳ??组）相比

ＲＡ－ＦＬＳ?（ＲＡ－ＦＬＳ组）中ＹＡＰ和ＴＡＺ的表达升高。为进一步明确ＹＡＰ和ＴＡＺ??蛋白水平的表达情况，我们提取ＮＣ－ＦＬＳ组和ＲＡ－ＦＬＳ组细胞的总蛋白，运用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ??检测两组细胞中ＹＡＰ、ＴＡＺ的表达情况，结果如图２所示：与ＮＣ－ＦＬＳ组相比，ＲＡ－ＦＬＳ??组细胞中ＹＡＰ和ＴＡＺ在蛋白水平上的表达也明显升高（Ｐ＜〇．〇５）。??

建、慢病毒包装、慢病毒感染细胞及嘌呤霉素筛选稳转细胞等一系列过程，实现稳定干扰??ＹＡＰ和ＴＡＺ表达细胞模型的构建，并采用荧光显微镜观察细胞模型中绿色荧光蛋白的表??达，图３－Ａ中，上图为光镜下所见的稳定转染的细胞，下图为荧光显微镜下相同视野，在??空载对照组（ｓｈ－Ｃ组）、干扰ＹＡＰ表达组（ｓｈ－ＹＡＰ组）、干扰ＴＡＺ表达组（ｓｈ－ＴＡＺ组）??中绿色荧光蛋白均明显表达，表明慢病毒能够感染ＲＡ－ＦＬＳ。然后，为了进一步分析ＲＡ－ＦＬＳ??中ＹＡＰ、ＴＡＺ基因的干扰情况，运用ＲＴ－ｑＰＣＲ检测各组ＲＡ－ＦＬＳ中ＹＡＰ、ＴＡＺ的ｍＲＮＡ??表达水平，结果如图３－Ｂ所示：与空白对照组（ＮＣ组）、ｓｈ－Ｃ组相比，ｓｈ－ＹＡＰ组细胞中??ＹＡＰ的ｍＲＮＡ表达明显下降（Ｐ＜０．０５?），?ｓｈ－ＴＡＺ组细胞中ＴＡＺ的ｍＲＮＡ表达明显下降??（尸＜０．０５），表明在慢病毒载体感染ＲＡ－ＦＬＳ后，可以分别干扰ＹＡＰ和干扰ＴＡＺｍｌＷＡ??水平的表达。同时，为了研宄各组ＲＡ－ＦＬＳ中ＹＡＰ和ＴＡＺ蛋白水平的表达，我们提取各??组ＲＡ－ＦＬＳ的总蛋白，采用Ｗｅｓｔｅｒｎ?Ｂｌｏｔ进行检测，结果如图３－Ｃ所示：与ＮＣ组、ｓｈ－Ｃ??组相比
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本文编号：2847733