miR-146a调控绝经后骨质疏松的作用机制研究

发布时间：2020-10-19 22:34

　　 【背景和目的】:骨质疏松多发于老年群体及绝经后的女性群体,分为年龄相关的骨质疏松和绝经后骨质疏松,患者骨密度降低,骨小梁数量减少,骨折风险增加。而且骨质疏松骨折后易引起其他并发症,影响患者生活质量,带来一系列社会经济学问题。骨质疏松是一种由骨代谢异常导致的退行性疾病,而骨代谢是由控制骨形成的细胞——成骨细胞,和调控骨吸收的细胞——破骨细胞共同作用的,骨质疏松的发病主要是由于破骨细胞活性大于成骨细胞活性导致的。已应用的治疗骨质疏松的药物也主要是通过调控这两种细胞的活性进行治疗。miRNA是一类长度为18-25个核苷酸的非编码小RNA,主要通过降解mRNA的3’-UTR和抑制转录后翻译来调控基因的表达。诸多研究证明miRNA能调控成骨细胞和破骨细胞的增殖,分化和凋亡,同时miRNA也在骨质疏松疾病的发生发展及诊断治疗中起到重要作用。本研究通过芯片筛选出和绝经后骨质疏松相关的miRNA,并研究其对成骨细胞和破骨细胞的调控,试图为骨质疏松的治疗寻找新靶点和新的机制。【方法】:本研究利用了外加雌激素刺激和OVX导致的雌激素缺失模型,检测了雌激素对骨髓单核巨噬细胞(BMM)增殖、凋亡和破骨分化的影响。并用雌激素受体抑制剂阻断了雌激素受体,以验证雌激素对BMM增殖、凋亡和破骨分化的影响是否通过雌激素受体(ER)介导。随后我们构建了双侧卵巢切除(OVX)导致的骨质疏松小鼠模型,在假手术组(sham)和OVX组之间用miRNA芯片筛选出明显变化的miR-146a。构建miR-146a敲基因小鼠(miR-146a~(-/-)),并在野生型(WT)和miR-146a~(-/-)小鼠中构建OVX模型,利用microCT对其骨微结构进行分析,同时对组织内?血清内?细胞内相关标志物进行检测。体外过表达和降低miR-146a并检测其对成骨细胞和破骨细胞分化的影响。体外共培养WT-sham?WT-OVX和miR-146a~(-/-)-sham?miR-146a~(-/-)-OVX小鼠的成骨细胞和破骨细胞,检测其培养上清中相关细胞因子的表达。【结果】:雌激素能抑制BMM增殖和破骨分化,促进BMM凋亡,且这一作用是通过ER介导的。miR-146a在雌激素缺失的骨质疏松小鼠中表达明显升高。miR-146a miR-146a~(-/-)小鼠与WT小鼠骨量无明显差异,但骨转换率增加。MiR-146a抑制成骨细胞和破骨细胞分化。WT小鼠OVX后骨量减少,破骨细胞活性增强;miR-146a~(-/-)小鼠OVX后骨量不仅没有下降,反而上升,破骨细胞的活性未见增强,同时其骨微环境中M-CSF?RANKL/OPG含量下降。【结论】:miR-146a负调控成骨细胞与破骨细胞分化。在雌激素缺失引起的骨质疏松中,敲除miR-146a能降低骨微环境中的M-CSF?RANKL/OPG含量,从而降低破骨细胞活性,保护骨量丢失。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R580
【部分图文】：

上海交通大学医学院硕士学位论文老龄人口还在以每年 800 万人的速度增加;有关专家预计，至 2050 年，我国老龄人口将达到总人口的 1/3。根据 WHO 的估计，50 岁以上女性中约 30%罹患此病，另外随着人口老龄化发展，这个比例仍然在持续上升[11]。据预测中国大陆 2030 年骨质疏松性骨折年发生 436 万例次，至 2050 年达 599 万例次，相应的医疗支出达 178亿美元和 254 亿美元[1-6, 12]。女性一生发生骨质疏松性，骨折的危险性(40%)高于乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌的总和，男性一生发生骨质疏松性骨折的危险性(13%)高于前列腺癌。患有骨质疏松的患者日常生活中骨折发生率高达 40%，且主要发生在脊柱、髋部、腕部[8]。骨折造成的运动性和自主性缺失，显著降低了患者生活质量[13]，且脊柱骨折和髋部骨折会导致患者死亡率上升，主要原因是长期卧床导致的肺炎和血管栓塞等并发症[8]。骨质疏松症已经成为我国所面临的重要公共健康问题。因此研究出有效的骨质疏松症的预防与治疗方法迫在眉睫。

脏和骨髓中检测到受 NF-κB 调节的基因表达上调[51]免疫性失调、髓质增生和自发性肿瘤[52]。关于 miR尚未有文献报道，但 miR-146a 被证实在类风湿性关作用，主要通过靶向抑制 TRAF6[53]。我们已有的实验体内破骨细胞活性明显增强，且 miR-146a 敲除老年重。这些证据都支持我们提出的 miR-146a 与骨代谢调义在于可以探究 miR-146a 的新功能，同时可以为骨能靶点。与绝经后骨质疏松动态的，代谢水平很高的器官，骨组织中不仅有矿化统，同时伴随着血管侵入，骨微环境中的诸多细胞因旁分泌途径在不同细胞间发挥作用。绝经后骨质疏松

细胞用 4%对聚甲醛固定 30 分钟，PBST 洗干净后用 0.5%Triton-100 通透 15 分钟 用 5%BSA 封闭 1 小时，加入 1：200 的 F4/80 一抗，4°C 过夜，PBST 洗干净后加入荧光二抗，室温孵育 1 小时，DAPI 染核，用 PBST 洗干净，用荧光封片剂封片后在荧光显微镜下拍照。1.2 实验结果1.2.1 BMM 与破骨细胞的鉴定分离小鼠的 BMM 并用其标志物 F4/80 流式鉴定，发现 F4/80 阳性的细胞率达到 97.2%(图 1.1A)。同时用 F4/80 免疫荧光染色鉴定分离的小鼠 BMM(图 1.1B)。用75ng/ml 浓度的细胞因子 RANKL 诱导小鼠 BMM 破骨分化，5 天后形成成熟的破骨细胞，TRAP 染色鉴定成熟的破骨细胞。其中白色箭头标注为成熟破骨细胞，绿色箭头标注为正在分化过程的破骨细胞，黑色箭头标注为未分化的 BMM (图 1.1C)。
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本文编号：2847808