番石榴叶总三萜改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗

发布时间：2020-10-22 02:39

　　 目的:观察番石榴叶总三萜(TTPGL)对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的改善作用,并探讨其可能的作用机制。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导其分化,给予TTPGL(0.3、1、3、10μg/L),并设溶媒(0.1%DMSO)组、阳性药正钒酸钠(Van,10μmol/L)组、正常对照(control)组和模型(model)组,药物作用48 h。MTT法检测药物对前脂肪细胞活力的影响,油红O染色法观察其对细胞分化的影响。建立IR模型后,药物处理48 h,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)检测IR脂肪细胞上清液中葡萄糖消耗量;比色法检测游离脂肪酸(FFA)水平;ELISA法检测脂肪因子分泌水平;real-time PCR检测IR脂肪细胞蛋白酪氨酸激酶1B(PTP1B)的mRNA表达量;Western blot检测磷酸化胰岛素受体底物1/胰岛素受体底物1(p-IRS-1/IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B/蛋白激酶B(p-Akt/Akt)的蛋白水平。结果:与溶媒组比较,TTPGL显著提高了前脂肪细胞的活力并抑制其分化(P0.01)。与IR溶媒组比较,无论在基础状态下还是胰岛素刺激状态下,TTPGL(1-10μg/L)均显著地促进了IR脂肪细胞葡萄糖消耗(P0.01);TTPGL(0.3~3μg/L)显著抑制FFA的产生(P0.01)。与模型组比较,TTPGL(0.3和3μg/L)显著增加IR脂肪细胞脂联素的分泌(P0.05)并抑制TNF-α的分泌(P0.01),TTPGL(3μg/L)对抵抗素的分泌有显著抑制作用(P0.05),对瘦素分泌无显著作用;TTPGL(3μg/L)显著下调IR脂肪细胞PTP1B的mRNA表达(P0.01);TTPGL(3μg/L)极显著上调p-IRS-1/IRS-1的水平;TTPGL(0.3和3μg/L)显著上调p-Akt/Akt的蛋白水平(P0.05)。结论:TTPGL具有显著改善3T3-L1脂肪细胞IR的作用,其作用机制可能与TTPGL下调了IR脂肪细胞PTP1B mRNA的表达、同时上调p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的蛋白水平有关。
【部分图文】：

课题采用3T3-L1脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，继续探讨TTPGL对3T3-L1脂肪细胞IR的改善作用，并通过观察TTPGL对IR脂肪细胞蛋白酪氨酸激酶1B(proteintyrosinephosphatase1B，PTP1B)的mRNA的表达以及对胰岛素受体底物1(insulinreceptorsubstrate1IRS-1)、蛋白激酶B(proteinkinaseB，Akt)磷酸化的影响，揭示其改善胰岛素抵抗的作用机制。材料和方法1材料1．1样本与试剂3T3-L1前脂肪细胞株购自中国医学科学院北京协和细胞资源中心;番石榴叶总三萜由暨南大学中药与天然药物化学研究所张晓琦教授提供，其分子结构式见图1;高糖DMEM培养基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均购自Gibco。MTT购自Amresco;地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、油红O和DMSO购自Sigma;正钒酸钠(sodiumorthovanadate，Van)购自阿拉丁公司;无水乙醇、异丙醇、多聚甲醛和冰乙酸购自天津市北联精细化学品开发有限公司;TRIzol购自Invitrogen;DNA引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成;ReverTraAceqPCRRTKit和SsoFastEvaGreenSupermixqPCRKit购自TOYOBO;抗GAPDH、IRS-1、p-Akt(Ser473)和Akt的抗体购自CST;抗p-IRS-1(Tyr632)的抗体购自Abcam。Figure1．ChemicalstructuralformulaofTTPGL图1番石榴叶总三萜的化学结构式1．2主要仪器ELX800多功能酶标仪(Bio-Tek);BR4i低温高速离心机(Thermo);TS100倒置显微镜(Nikon);DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);79-1磁力加热搅拌器(北京六一仪器厂);HC-3018R高速冷冻离心机(科大创新股份有限公司);PTC-1152PCR仪(Bio-Rad);SMYUV-750紫外分光光度计(上海康华生化仪器制造厂);Trans-BlotTurbo蛋白电转仪(Bio-Rad);ImageQuantLAS4000凝胶成像系统(GEHealthcare)。2方法2．13T3-L1前脂肪细胞的诱导分化

Figure7．TheeffectsofTTPGLonthelevelofadipocytokinesinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．▲▲P＜0.01vscontrolgroup;*P＜0.05，＊＊P＜0.01vsmodelgroup．#P＜0.05，##P＜0.01vsVangroup．图7番石榴叶总三萜对胰岛素抵抗脂肪细胞脂肪因子分泌的影响Figure8．TheeffectsofTTPGLonthemRNAexpressionofPTP1BinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．＊＊P＜0.01vsmodelgroup．图8番石榴叶总三萜对胰岛素抵抗脂肪细胞PTP1BmR-NA表达的影响3μg/LTTPGL显著增加了p-IRS-1/IRS-1的水平(P＜0.01);TTPGL(0.3和3μg/L)显著增加p-Akt/Akt水平(P＜0.01)。TTPGL在3μg/L剂量下对p-IRS-1/IRS-1和p-Akt/Akt的影响与Van比较没有显著性差异。在0.3μg/L剂量下对p-Akt/Akt的作用明显低于Van(P＜0.01)，见图9。讨论随着人们生活水平的提高，肥胖人数比例逐年增加，糖尿病与之密切相关，在2型糖尿病人群中，75%的患者伴有肥胖［4］。有研究表明，当肥胖患者通过调节饮食或运动有效的控制了体重，可以在一定程度上改善胰岛素抵抗，减轻糖尿病症状［5］。除此之外，胰岛素抵抗的机制还可能、糖毒性、脂毒性相关［6-7］，同时，胰岛素的生物学效应还受脂肪因子、PTP1B、PPARγ等多种因子的调节［8-9］。脂肪细胞分为两种，未分化的前脂肪细胞又叫小脂肪细胞，分化成熟的脂肪细胞又叫大脂肪细胞，其中大脂肪细胞数量增多和体积增大对脂肪的积累和肥胖的发生起着重要作用［10］。本实验采用3T3-L1前脂肪细胞，常规培养并诱导其分化，在给予药物干预后，观察药物对细胞的增殖及分化的影响。我们观察到TTPGL对3T3-L1前脂肪细胞增殖有促进作用，此时增加的是小脂肪细胞数量;在分化实验中，TTPGL显著抑制细胞分化的作用?

Figure9．TheeffectofTTPGLontherelativeproteinlevelsofp-IRS-1andp-AktinIRadipocytes．Mean±SD．n=6．＊＊P＜0.01vsmodelgroup;##P＜0.01vsVangroup．图9番石榴叶总三萜对胰岛素抵抗脂肪细胞p-IRS-1/IRS-1、p-Akt/Akt水平的影响糖毒性与脂毒性在IR过程中发挥重要作用，同时IR又会加重糖毒性与脂毒性，从而形成恶性循环［11-12］。在本实验中，我们采用分化成熟的脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，给药处理后，观察药物对IR脂肪细胞糖脂代谢的影响。本实验发现，无论是在基础状态下还是胰岛素刺激状态下，TTPGL在较低剂量下显著促进胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗并抑制FFA的产生，具有改善IR脂肪细胞糖脂代谢的作用。脂肪组织是一个巨大的内分泌器官，它可以分泌多种脂肪因子从而实现对糖脂代谢、炎症等生理活动的调节。这些脂肪因子在体内增多或减少，对胰岛素生物学效应的发挥有重要影响［13］。研究表明一些脂肪因子例如脂联素等具有胰岛素增敏剂的作用［14］;另外一些脂肪因子如TNF-α、抵抗素等可引起胰岛素抵抗［15-16］;瘦素对胰岛素抵抗具有双向调节作用，在一定浓度下具有抑制食欲促进糖脂代谢的作用，当出现瘦素抵抗，瘦素水平升高并引起胰岛素抵抗［17］。在脂肪因子分泌的实验中，发现TTPGL显著促进了IR脂肪细胞脂联素的分泌并抑制其TNF-α的分泌，在较高浓度下对抵抗素的分泌也有抑制作用，与阳性药Van作用相似。通过以上实验，我们发现TTGPL具有显著改善3T3-L1胰岛素抵抗脂肪细胞糖脂代谢以及脂肪因子分泌的作用，认为其具有改善IR的作用，其作用与Van一致。Van作为PTP1B的抑制剂，通过抑制PTP1B而改善胰岛素信号通路转导当胰岛素与胰岛素受体结合后主要通过IRS-1/PI3K/Akt信号
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本文编号：2850977