糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由遗传和环境因素相互作用而导致的以高血糖为主要特征的代谢异常综合征,随着人口老年化的加剧以及人们生活方式的改变,中国糖尿病的发病率逐年上升,从而对家庭和社会带来了沉重的负担。糖尿病患者常见的慢性并发症是糖尿病神经病变(diabetic neuropathy,DN)导致的神经病理性疼痛,大约有超过50%的成人糖尿病患者存在糖尿病神经病变。糖尿病神经病变患者经常会出现痛觉过敏或异常性疼痛,表现为对伤害性刺激的过度敏感,或者将正常刺激视为痛苦的刺激。然而目前有关糖尿病神经病变的神经生物学机制还未完全阐明,治愈糖尿病神经病变仍然面临很大挑战。前人的研究表明,脊髓背角对糖尿病神经病变痛感觉信号的感知至关重要。研究发现在炎症或神经损伤后脊髓背角可能会出现中枢致敏,这可能导致糖尿病神经病变中原发性传入和脊髓神经可塑性增加以及脊髓背角神经元过度活动。其中脊髓背角神经元活动过度的神经机制可能涉及N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体。一方面,注射NMDA诱导了神经结扎大鼠中脊髓L2椎间神经元的钙内流增加的更加明显;另一方面,NMDA受体的拮抗作用显著降低了脊神经结扎的大鼠背角神经元的诱发反应。这种效应可能涉及NMDA受体的NR2B亚基,因为有大量研究证据表明脊髓NMDA受体的NR2B亚基在伤害性信号处理和病理性疼痛中发挥重要作用。目前研究糖尿病神经病变的大多数动物研究来自对啮齿动物注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备的动物模型,链脲佐菌素是一种胰腺β-细胞的细胞毒素,这种啮齿类动物发展出类似于Ⅰ型糖尿病的综合征。Ⅰ型糖尿病性神经病变与脊髓初级传入末梢谷氨酸释放增加有关。STZ诱导的糖尿病大鼠表现出触觉异常性疼痛和痛觉过敏,并且这种触觉异常性疼痛与NMDA受体中NR2B亚基在脊髓中的表达增加有关。然而,NMDA受体是否参与Ⅱ型糖尿病动物模型的糖尿病性神经病变尚不清楚。鉴于目前确诊的成人糖尿病病例中90-95%是Ⅱ型糖尿病,而且动物研究也已证明在肥胖相关的前驱糖尿病动物中存在糖尿病性神经病变,因此研究NMDA受体在前驱糖尿病神经病变中的作用将至关重要。NMDA受体的功能受Src家族酪氨酸激酶的严格调控。在脊髓中,NR2A和NR2B是NMDA受体主要的亚基,而NR2B亚基在脊髓背角的浅表层有很高的表达。更重要的是,在中枢神经系统中NR2A和NR2B亚基都可以被酪氨酸激酶磷酸化。先前研究表明脊髓中含有NR2B的NMDA受体负责维持化学诱导的神经性疼痛,并且Fyn激酶在NR2B亚基Tyr1472处的磷酸化对于维持神经性疼痛是必需的。然而,很少有研究关注Fyn激酶在前驱糖尿病性神经病变中的作用。因此,本研究旨在研究Fyn介导的NMDA受体信号级联反应在前驱糖尿病神经病变小鼠脊髓中的作用。第一部分NMDA受体NR2B亚基在小鼠前驱糖尿病神经病变中的作用实验目的:检测NMDA受体NR2B亚基在小鼠前驱糖尿病神经病变中的作用。实验方法:1.实验分组:成年雄性C57BL6/SV129小鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,每组各40只。高脂饮食诱发前驱糖尿病动物模型:糖尿病组小鼠用高脂肪饲料饲养,对照组小鼠用正常饲料饲养,均饲养16周或24周。在16和24周饲养结束后的第一周分别收集两组小鼠的体重和血糖数据。2.行为学测试:所有行为测试均在16周或24周高脂饮食或者正常饮食结束后进行。每只小鼠接受两次行为测试。通过von Frey针刺痛觉测试套件测定小鼠的触觉反应。测量von Frey单丝的机械性退缩阈值来评价神经病变的进展,使用上下法确定50%的退缩阈值。在Von Frey检测后的第二天,使用热板测试来确定热敏感性。3.检测各组NR2B亚基的表达情况:收集16周或24周饮食处理后的小鼠的脊髓组织,通过Western blotting实验分析脊髓中NR2B亚基的表达情况以及NR2B亚基在Tyr1472处的磷酸化的水平。NR2B活化指归一化的pNR2B/总NR2B水平。4.抑制NR2B亚基后的行为学表现:在小鼠脊髓的L5和L6之间的椎间隙,鞘内注射5μL对照溶剂(磷酸盐缓冲盐水中的1%DMSO)或Ro25-6981(含有选择性NMDA受体NR2B亚基的拮抗剂)。注射五分钟后,进行小鼠行为测试。实验结果:1.高脂饮食对小鼠体重、血糖水平和食物摄入量的影响:第一周高脂饮食后,与正常饮食的小鼠相比,小鼠表现出轻微增加的体重和食物摄入量,但血糖水平并没有增加。而16或24周的高脂饮食后小鼠体重、食物摄取量以及血糖水平相对于正常饮食对照小鼠都明显增加。2.高脂饮食对小鼠触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的影响:与正常饮食对照小鼠相比,16和24周高脂饮食导致小鼠出现触觉异常性疼痛和热痛觉过敏减退。此外,与高脂饮食16周相比,高脂饮食24周时小鼠的触觉异常性疼痛和热痛觉减退更加严重。3.高脂饮食对小鼠脊髓中NR2B亚基表达的影响:与正常饮食对照小鼠相比,高脂饮食小鼠脊髓中的NR2B亚基表达在16和24周时有所增加。此外,高脂饮食24周时NR2B亚基在脊髓中的表达相比高脂饮食16周时更强。NR2B亚基在Tyr1472处的磷酸化也表现出类似的变化,即NR2B的活化(p-NR2B与NR2B之比)增加。4.鞘内注射NMDA受体NR2B亚基的拮抗剂对小鼠行为学的影响:鞘内注射Ro 25-6981能够缓解高脂饮食引起的触觉异常性疼痛,但不影响热痛觉消退。鞘内注射Ro 25-6981的量从5 μg增加到20 μg时,小鼠的缩爪阈值显著增加。然而,鞘内注射Ro 25-6981的任一剂量都不会改变小鼠的舔爪潜伏期。实验结论:NMDA受体NR2B亚基的表达和功能的增加有助于Ⅱ型糖尿病神经病变的发病进展。第二部分Fyn介导的NMDA受体信号级联反应在小鼠前驱糖尿病神经病变中的作用实验目的:检测Fyn介导的NMDA受体信号级联反应在小鼠前驱糖尿病神经病变中的作用。实验方法:1.实验分组:成年雄性Fyn野生型C57BL6/SV129小鼠和Fyn敲除(Fyn-/-)小鼠(C57BL6/SV129背景),随机分为正常对照组和糖尿病组,每组各40只。糖尿病组用高脂肪饲料饲喂16周或24周。体重和血糖数据在高脂饮食处理16和24周后的第一周收集。2.行为学测试:所有行为测试均在16周或24周普通饮食或高脂饮食后进行。每只小鼠接受两次行为测试。通过von Frey针刺痛觉测试套件测定小鼠的触觉反应。测量von Frey单丝的机械性退缩阈值来评价神经病变的进展,使用上下法确定50%的退缩阈值。在Von Frey检测后的第二天,使用热板测试来确定热敏感性。3.检测各组Fyn激酶和NR2B亚基表达水平:收集16周或24周饮食处理后的小鼠的脊髓组织,通过Western blotting实验分析脊髓中Fyn激酶和NR2B亚基以及NR2B亚基磷酸化的表达情况。4.检测Fyn激酶和NR2B亚基之间的直接相互作用:对野生型小鼠的脊髓样品和单克隆抗Fyn抗体免疫共沉淀,随后通过抗NR2B抗体进行免疫印迹分析。实验结果:1.高脂饮食对小鼠体重、血糖水平和食物摄入量变化:Fyn-/-小鼠和野生型小鼠在高脂饮食治疗后,体重,血糖水平和食物摄入量变化相似。第一周高脂饮食后,与正常饮食的小鼠相比,Fyn-/-小鼠表现出轻微增加的体重和食物摄入量,但血糖水平并没有增加。在16或24周的高脂饮食后,Fyn-/-小鼠表现出更明显的体重增加。另外,与正常饮食对照小鼠相比,高脂饮食喂养组中的食物摄取显著增加。此外,在16或24周的高脂饮食后,Fyn-/-小鼠的血糖水平相对于正常饮食对照小鼠有所增加。2.高脂饮食对小鼠触觉异常性疼痛和热痛觉过敏的影响:高脂饮食会导致Fyn-/-小鼠热痛觉减退,但不会引起触觉异常性疼痛。前驱糖尿病的Fyn-/-小鼠与正常饮食Fyn-/-小鼠比较,高脂肪饮食治疗16和24周后,小鼠表现出热痛觉减退,但没有触觉异常性疼痛。另外,与高脂饮食16周相比,高脂饮食24周时小鼠的热痛觉减退更明显。3.高脂饮食对小鼠脊髓中Fyn激酶表达的影响:高脂饮食未能改变野生型小鼠脊髓中Fyn激酶的表达。然而,与正常饮食喂养的小鼠相比,高脂饮食促进了野生型小鼠脊髓中Fyn激酶和NR2B亚基的相互作用,且这种相互作用在24周的高脂饮食中比16周时增强。4.高脂饮食对小鼠脊髓中NR2B亚基表达的影响:与正常饮食对照小鼠相比,16和24周的高脂饮食都增加了 Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B亚基的表达,且24周时NR2B亚基表达增加更强。然而,高脂饮食并没有改变Fyn-/-小鼠脊髓中NR2B的Tyr1472位点磷酸化水平。实验结论:Fyn介导的NR2B受体信号转导在调节前驱糖尿病性神经病变中起关键作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：
疼痛状况中的临床效用的证据。??１．?ＮＭＤＡＲ沿疼痛途径分布??伤害性信号从脊髓背角传递到大脑被称为上行通路（图１）。初级感觉神经??元（伤害感受器）的神经末梢检测到有害刺激。感觉神经被赋予识别有害的热，??化学或机械刺激的特定受体和通道。外周神经末梢的伤害性信号以动作电位的形??式沿轴突传递。初级感觉神经元的细胞体位于背根神经节（ＤＲＧ）和三叉神经节。??感觉神经元的中枢突终止于脊髓背角，在那里它们释放兴奋性神经递质，如谷氨??酸和Ｐ物质［５４］（图１）。??２６??
起的疼痛过敏反应的减轻［１２４，?１２５］，突出显示了?ＮＭＤＡＲ磷酸化在慢性疼痛发展??中的关键作用。在本节中，我们回顾主要蛋白激酶和磷酸酶（如钙调磷酸酶）在??慢性疼痛中的作用（图２）。??Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｌｓ??ＪＬＩ?Ｉ?ＪＩＭ??Ｐｈｙｓｉｏｌｐｇｉｃａｌ?ｓｔｉｍｕｉｇｊ?Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ?ｐａｉｎ／?ｇｉｕＮ３??／?Ａ?ＩＮＭＤＡＲ?Ｉ?Ｗｍ?Ｖ??／?ｘ－—．?Ｇｌｕｔａｍａｔｅ?Ｘ??＾?ｖ?ＨＩ?／??Ｐ〇Ｓ＜５ｙｎａｐ？ｉｃ?ｄ＜？ｒ５９ｌ?Ｈｏｒｎ?ｎｃ？ｒ〇ｆ？５??图２．调节神经性疼痛中的突触＿ＡＲ活性的信号机制。在神经性疼痛中，增加??的突触前ＮＭＤＡＲ活性促进谷氨酸从初级传入神经末梢释放，并增加神经元兴奋性??和ＫＣＣ２的蛋白水解切割，进而影响突触抑制。蛋白激酶（例如ＣＫ２，?ＣａＭＫＩＩ和??Ｓｒｃ）和磷酸酶（例如钙调磷酸酶）通过调节ＮＭＤＡＲ和与其相互作用的蛋白的磷??酸化来控制ＮＭＤＡＲ活性。??钙调磷酸酶（Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ）和ＣＫ２?（前者磷酸酶，后者是激酶）分别对ＮＭＤＡＲ??３１??
图２高脂饮食处理对ＮＲ２Ｂ水平及活化的影响（ｎ＝１０／组）。??对总ＮＲ２Ｂ水平（Ａ），ｐＮＲ２Ｂ对ＮＲ２Ｂ比率（Ｂ）进行蛋白质印迹分析。＊表??示与正常饮食对照有显著性差异（Ｐ?＜〇．〇５）?；＃表示相对于１６周有显著性差异（Ｐ＜０＿０５）。??３９??
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