Behcet病患者肠道微生物宏基因组学的研究

发布时间：2020-10-26 17:12

　　 背景:Behcet病(Behcet's Disease,BD)是一种以反复发作的口腔溃疡、生殖器溃疡、葡萄膜炎、皮肤病变等多系统损害为主要临床表现的慢性炎症性自身免疫性疾病。该疾病好发于中青年人群,其中很多患者会发生不可逆的盲目,很大程度上降低了患者的生活质量,加重了社会负担,因此对BD的研究具有重要的社会意义。BD的确切病因尚不清楚,目前研究表明BD是在遗传和环境感染因素上发生的自身炎症性免疫反应。Th17细胞过度活化、Th1细胞/Treg细胞比例失衡所致的异常免疫反应是BD发生的主要发病基础。近年来大量研究表明肠道微生物在调节宿主Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞中起着至关重要的作用。肠道微生物菌群失调可能导致多种自身免疫性疾病的发生,包括BD的发生。虽然已有研究者利用16S rRNA基因的保守性与特异性对BD患者进行肠道微生物菌群差异的研究,然而却未对BD患者肠道微生物菌群进行功能方面的研究。并且基于16SrRNA测序研究肠道微生物的方法有较大的局限性,而基于宏基因组学研究肠道微生物不但可以更全面的分析肠道微生物的结构,同时能进行肠道微生物功能方面的研究。本课题正是基于上述背景,进行了以下三个方面的研究:(1)利用16S rRNA测序方法研究免疫抑制剂对活动期BD患者肠道微生物的影响,以指导本课题宏基因组学研究中BD患者的纳入标准。(2)利用宏基因组学测序方法分析BD患者与正常人肠道微生物结构和功能的差异,探讨影响BD发生的肠道微生物菌群及可能的微生物作用机制。(3)利用16S rRNA测序方法分析BD患者和正常人口腔微生物结构差异,明确口腔微生物是否参与BD的发生,以及BD患者口腔微生物与肠道微生物间的相互关系。第一部分免疫抑制剂对活动期BD患者肠道微生物影响的研究目的:利用16S rRNA测序方法研究免疫抑制剂对活动期BD患者肠道微生物的影响,以指导本课题宏基因组学研究中BD患者的纳入标准。方法:分别收集活动期未用药BD患者、活动期已用药BD患者、正常人粪便。提取粪便DNA,PCR扩增后采用Illumina MiSeq测序仪行16S rRNA测序。对16S rRNA测序结果进行生物信息学分析。结果:活动期未用药BD患者与正常人肠道微生物的差异在操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)显著性差异分析、微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小(Linear Discriminate Analysis Effect Size,LEfSe)分析上均高于活动期已用药BD患者与正常人肠道微生物的差异。活动期未用药BD患者与活动期已用药BD患者组间也存在显著性差异。结论:药物免疫抑制剂对活动期BD患者肠道微生物菌群结构有影响。药物治疗在一定程度上能够扭转活动期BD患者肠道微生物失衡的状态。因此,在后期研究中我们严格筛选活动期未用药BD患者作为本研究的研究对象。第二部分BD患者肠道微生物宏基因组学研究目的:利用宏基因组测序技术分析分析BD患者与正常人肠道微生物结构及功能的差异,明确参与BD发生的微生物菌群,以及这些异常的肠道微生物菌群通过何种机制参与疾病的发生。方法:分别收集活动期未用药BD患者、正常人粪便。提取粪便DNA,采用Illmina TruSeq测序仪行宏基因组测序。对宏基因组测序结果进行生物信息学分析。结果:1、对宏基因组学数据微生物差异物种结果显示BD患者和正常人肠道微生物间分别有248个菌属和933个菌种存在显著性差异。其中,产乳酸菌和硫酸盐还原菌及低丰度的条件致病菌为BD患者富集的肠道微生物菌种,而产丁酸菌产甲烷菌为正常人富集的肠道微生物菌种。2、通过基因群物种(Metagenomic species,MGS)分析显示BD患者与正常人肠道微生物间存在有13个显著性差异的MGS。用这些MGS区分BD患者组与正常人组,得到接受者操作特征曲线下的面积(area under the receiver operating characteristic curve,AUC)为82.69%(95%可信区间:71.24%-94.14%)。3、结合京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和基因进化谱系:非监督基因自系同源簇(Evolutionary Genealogy of Genes:Non-supervised Orthologous Groups,eggNOG)数据集分析,发现BD患者与正常人肠道微生物存在449个显著性差异的KEGG同源基因(KEGG Orthologues,KO)和1859个显著性差异的EggNOG同源基因(EggNOG Orthologues,OG)。BD患者在膜转运、氨基酸转运和代谢、酶转运和代谢、能量产生和转换、无机离子转运和代谢方面富集。同时我们发现2个与热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)相关的OG在BD中富集,而一个与热休克蛋白20(Heat shock protein 20,HSP20)相关的KO在正常人中富集。在模块和路径水平,我们发现BD患者在肽聚糖合成系统、硫和脂质代谢、囊多糖转运系统、细菌Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统方面富集。结论:BD患者与正常人肠道微生物结构和功能均存在差异。在肠道微生物结构上,BD患者富集产乳酸菌和硫酸盐还原菌以及低丰度的条件致病菌,而缺乏产丁酸菌和产甲烷菌。对肠道微生物功能的研究发现这些菌可能通过肽聚糖合成系统、硫和脂质代谢、囊多糖转运系统、细菌III型和IV型分泌系统、HSP90参与了BD的发生。并根据以上研究结果对肠道微生物影响BD发病机制进行了解释。第三部分BD患者口腔微生物的研究目的:利用16s rRNA测序技术分析BD患者口腔微生物的组成和差异,以期明确口腔微生物是否参与了BD的发生,以及BD患者口腔微生物与肠道微生物之间的关系。方法:分别收集活动期未用药BD患者、正常人唾液。提取唾液DNA,PCR扩增后采用Illumina MiSeq测序仪进行16S rRNA测序。对16S rRNA测序结果进行生物信息学分析。结果:产乳酸菌Bifidobacteriaceae,Coriobacteriaceae,Lactobacillaceae以及硫酸盐还原菌Desulfovibrio为BD患者的富集菌,而Neisseriales为正常人的富集菌。结论:BD患者差异性口腔微生物与差异性肠道微生物具有一致性,与肠道微生物共同参与了BD的发生。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R593.2
【部分图文】：

重庆医科大学博士研究生学位论文，活动期未用药 BD 病患者与活动期已用药 BD 病患者间肠道微生物存在 7 个性差异菌属。提示活动期未用药 BD 患者与活动期已用药 BD 患者间肠道微生构存在差异。3 物种 LEfSe 差异分析为了进一步明确活动期未用药 BD 患者、活动期已用药 BD 患者和正常人之组间影响最显著的肠道微生物群落或物种，研究组对组间分别进行了物种 LE异分析。3.1 活动期未用药 BD 患者组与正常人组间肠道微生物 LEfSe 差异

在 属 水 平 上 ， Phascolarctobacterium, Veillonella, Porphyromonas, LeptotrichiaCapnocytophaga, SR1_genera_incertae_sedis, Coprobacter, Lutispora, RothiaGranullcatella, Weissella, Sphingomonas, Lachonanaerobaculum 13 种菌属为活动期未用药 BD 患者肠道微生物中影响最大的富集菌群。而 Roseburia, DialisteClostridium XVIII, Butyricicoccus 4 种菌属为正常人组影响最大的富集菌群（图1.1）。2.3.2 活动期已用药 BD 患者与正常人肠道微生物 LEfSe 差异对活动期已用药 BD 患者与正常人肠道微生物 LEfSe 差异，结果显示在属水平上，Phascolarctobacterium, Enterococcus, Fusicatenibacter, Weissella, ActinomyceTrichococcus 6种菌属为活动期已用药BD患者肠道微生物中影响最大的富集菌群而 Ruminococcus, Parabacteroides, Odoribacter, Turicibacter 4 种菌属为正常人组肠道微生物中影响最大的富集菌群（图 1.2）。

重庆医科大学博士研究生学位论文3.3 活动期未用药 BD 患者与活动期已用药 BD 患者肠道微生物 LEfSe 差异我们进一步对活动期未用药 BD 患者与活动期已用药 BD 患者肠道微生物fSe 分析。结果显示在属水平上，Bifidobacterium, Veillonella, Coprobacter, Roeptotrichia, Sphingomonadales, Capnocytophaga 7种菌属为活动期未用药BD患道微生物中影响最大的富集菌群。Fusicatenibacter, Dialister, ClostridiumXtyricicoccus 4 种菌属为活动期已用药 BD 患者肠道微生物中影响最大的富集(图 1.3)。
【参考文献】

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1 龚兴国,于红;热休克蛋白60的研究进展[J];中国病理生理杂志;2004年11期

本文编号：2857274