胰岛素对肝细胞GABARAPL1转录调控的机制研究

发布时间：2020-10-29 15:16

　　 目的检测胰岛素对肝细胞GABARAPL1表达的影响,并进一步探讨胰岛素对其转录调控的机制。方法体外培养人永生化肝细胞(HL-7702),将细胞分为五组:A组(对照组)、B组(自噬激活组)、C组(胰岛素组)、D组(胰岛素阻断组1)、E组(胰岛素阻断组2),处理方法如下:除A组外均加入100nM雷帕霉素处理6小时,C、D、E组再分别加入1μM胰岛素,其中D、E组需提前30分钟分别加入LY294002(50μM)、Wortmannin(100nM),4小时之后细胞处理完成。通过提取各组细胞蛋白质样品,利用Western Blotting法检测自噬相关基因GABARAPL1、LC3、Beclin1的表达情况,同时可借助透射电镜观察各组细胞内自噬小体数量的表达差异。随后通过前期已成功构建的胰岛素调控识别模序失活突变体,及含有GABARAPL1启动子序列的荧光素酶报告系统,利用Luciferase Assay检测荧光素酶活性,并比较其转录活性差异,寻找参与胰岛素对GABARAPL1转录调控的反应元件,最后通过非放射性凝胶迁滞实验对该转录调控的结合位点予以确认。结果1.Western Blotting结果示:相比于B组,C胰岛素组可见GABRABPAL1、LC3、Beclin1表达减弱(P0.05);相比C组,D胰岛素阻断组可见GABRABPAL1、LC3、Beclin1表达增强(P0.01)。2.透射电镜下观察自噬小体的变化:相比于B、D、E组,C胰岛素组自噬小体数目明显减少。3.荧光素酶活性检测:失活GABARAPL1基因启动子区域内IRE1反应元件,其转录活性明显下降(P0.01)。4.非放射性凝胶迁滞实验检测:与其它阴性对照组相比,自噬激活组及胰岛素阻断组可见其核蛋白质与标记探针(biotin-FoxO1)形成的滞后结合带,自噬激活组核蛋白质与标记探针及FoxO1抗体所形成的结合带更为明显且滞后,胰岛素组内其结合带明显减弱。结论1.胰岛素抑制肝细胞GABARAPL1的基因表达。2.胰岛素通过FoxO1与GABARAPL1基因启动子区域内IRE1反应元件的脱离,实现对肝细胞GABARAPL1转录活性的调控。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

ARAPL1 启动子序列的荧光素酶报告系统，采取直接点突变联合“序的方法，失活 GABARAPL1 启动子区域内的各个胰岛素反应元件，ferase Assay 检测荧光素酶活性比较其转录活性差异，寻找其主要转位点。图 3.1 截除突变失活 GABARAPL1 基因启动子 IRE 反应位点示意图Gaparapl1SspI SphI BamHI-1715-1204-818+114IRE 11-15 IRE 7-10 IRE5-6IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SspI SphI BamHI-818+114IRE 7-10 IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1SphI BamHI-818+114IRE5-6 IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 2-4 IRE 1-91BsiI-437Gaparapl1BamHI+114IRE 1-91GEC1GEC1-GED1GEC1-GED2GEC1-GED3GEC1-GED4

图 4.2 透射电镜下各组自噬小体数量注:A组:对照组,B组:自噬激活组,C组:胰岛素组,D组:胰岛素阻断组1,E组胰岛素阻断组2,上图均为放大 20000 倍透射电镜下拍片,箭头所指即为自噬小体.4.3 荧光素酶活性检测及凝胶迁移电泳实验4.3.1 荧光素酶活性检测报告本课题组前期已成功构建胰岛素调控识别模序失活突变体，及其含有GABARAPL1 启动子序列的荧光素酶报告系统，并通过 Luciferase Assay 检测荧光素酶活性比较其转录活性差异，实验结果提示：接受胰岛素信号调控的结构域主要位于 GABARAPL1 基因启动子的 GEC1-D3 片段内，并且在该片段内，失活IRE1 反应位点，其转录活性明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图 4.5 GABARAPL1 基因启动子 IRE1 与转录因子 FoxO1 结合反应的 EMSA自噬激活组核蛋白质+Probe,B 组:胰岛素组核蛋白质+Probe,C 组:胰岛素阻断+Probe,D 组:自噬激活组核蛋白质+Probe+FoxO1 抗体,E 组:自噬激活组核蛋白normal lgG,F 组:自噬激活组核蛋白质+Probe+过量冷探针,G 组:阴性对照,只加针.
【参考文献】

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1 刘乐萍;胰岛素对自噬相关基因GABARAPL1表达的影响及其转录调控机制的初步研究[D];南华大学;2014年

本文编号：2861083