Wip1调控间充质干细胞治疗小鼠1型糖尿病的机制研究

发布时间：2020-11-10 05:01

　　 目的:利用野生型p53诱导磷酸酶1(Wild type p53-induce phospatase 1,Wip1)基因敲除鼠,探讨Wip1调控间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSC)治疗小鼠1型糖尿病(TypeΙdiabetes,T1DM)的作用与机理,为阐明MSC治疗T1DM的作用机制提供理论与实验依据。方法:1.Wip1基因敲除鼠MSC的分离培养与鉴定。分离1周龄乳鼠,通过基因型鉴定确定Wip1敲除鼠,并分别培养正常MSC(Wip1~(+/+)MSC)与Wip1基因敲除的MSC(Wip1~(-/-)MSC)。采用Giemsa染色法观察细胞形态,流式细胞术鉴定细胞表型,体外分别进行成脂和成骨的诱导分化,并通过油红O染色和碱性磷酸酶染色鉴定分化能力,同时采用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测成脂关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein alpha,CEBP/ɑ)及成骨关键转录因子Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor,RunX2)、骨钙素(Osteocalcin)的表达。2.Wip1调控MSC治疗T1DM的疗效观察。利用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)构建小鼠T1DM模型,通过尾静脉分别输注5×10~5Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC观察MSC治疗T1DM的疗效。实验分为正常对照组、T1DM模型组、Wip1~(+/+)MSC治疗组及Wip1~(-/-)MSC治疗组。每周检测小鼠一般生理状态、血糖和体重变化;治疗4周后采用HE染色和免疫组化法检测各组小鼠胰腺组织病理改变及胰岛素的分泌情况;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠血清中炎症因子IFN-γ、IL-4及IL-17a的表达,流式细胞术检测各组小鼠脾脏T淋巴细胞胞内炎症因子的表达。3.Wip1调控MSC治疗T1DM的机制探讨。利用Wip1~(+/+)MSC及Wip1~(-/-)MSC基因芯片结果结合生物信息学分析,筛选表达差异显著且与免疫调控作用相关的靶基因BST2,采用q-PCR和Western blot法检测Wip1~(-/-)MSC中BST2的表达;进一步构建Wip1-EGFP过表达载体,转染293T细胞,Western blot检测Wip1与BST2的表达相关性;进而结合文献检索,获得BST2的作用靶基因IFN-α,并采用q-PCR及ELISA法检测Wip1~(-/-)MSC中IFN-α的表达;进一步,将人工合成的BST2 siRNA转染Wip1~(-/-)MSC细胞,q-PCR检测BST2与IFN-α的表达相关性。为证实Wip1在体内是否通过BST2-IFN-α调控MSC免疫功能,我们首先采用免疫荧光法观察Wip1~(+/+)和Wip1~(-/-)两种MSC在胰腺组织中的归巢情况,进一步利用ELISA法检测各组小鼠胰腺及其周围淋巴结(PLN)中相关炎症因子IFN-α、TNF-α、IL-17a、IL-4和IL-10的表达,q-PCR法检测各组小鼠脾脏淋巴细胞IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表达。结果:1.通过鼠尾基因型检测成功获得Wip1~(-/-)小鼠,同时分离培养Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC,培养至P3代,经Giemsa染色,倒置显微镜下观察可见,两种MSC细胞核均为椭圆形,均呈长梭形、旋涡状贴壁生长;两种MSC均高表达Sca-1、CD29、CD90,低表达CD34、CD45、CD11b和MHCII;两种MSC经成脂诱导分化后,油红染色均可见大量红色脂滴,q-PCR检测结果显示,诱导组的PPAR-γ和CEBP/α表达均显著上调;成骨诱导分化结果表明,诱导组细胞碱性磷酸酶活性增强,q-PCR检测诱导组的RunX2及Osteocalcin表达亦显著增加,上述结果提示,成功获得Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC。2.为阐明Wip1~(-/-)MSC对小鼠T1DM的治疗效果,我们首先建立了小鼠T1DM模型,进一步经尾静脉输注Wip1~(+/+)MSC或Wip1~(-/-)MSC,结果表明,经Wip1~(+/+)MSC治疗后小鼠血糖逐渐下降,体重逐步回升;而Wip1~(-/-)MSC治疗后血糖下降不明显,体重上升不及Wip1~(+/+)MSC治疗组。病理学检测结果显示,Wip1~(+/+)MSC治疗组,胰岛组织相对完整,胰岛素分泌增加明显;而Wip1~(-/-)MSC治疗组胰岛组织仍不完整,胰岛素分泌亦不及Wip1~(+/+)MSC治疗组明显。流式细胞术及ELISA检测结果表明,Wip1~(-/-)MSC治疗组与Wip1~(+/+)MSC治疗组相比较,脾脏淋巴细胞Th1细胞亚群IFN-γ的表达及血清中促炎因子IFN-γ及IL-17a的分泌均显著上调,而抗炎因子IL-4的分泌则显著下调。3.为探讨Wip1调控MSC治疗小鼠T1DM的作用机制,我们首先通过Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC基因芯片的结果,筛选获得差异显著的BST2基因,进而采用q-PCR及Western blot证实Wip1~(-/-)MSC高表达BST2;通过构建Wip1-EGFP过表达载体转染293T细胞实验进一步证明Wip1调控BST2的表达。为明确BST2的作用靶基因为IFN-α,我们采用q-PCR和Western blot法检测Wip1~(-/-)MSC是否表达IFN-α,结果显示Wip1~(-/-)MSC亦高表达IFN-α。进而采用siRNA敲减Wip1~(-/-)MSC中BST2的表达,结果表明IFN-α的表达亦显著下调,上述结果提示Wip1通过调控BST2进而影响IFN-α的表达达到调控MSC免疫调节功能的目的。进一步小鼠体内实验检测结果显示,Wip1~(+/+)MSC和Wip1~(-/-)MSC均可归巢至受损的胰腺组织进而发挥治疗作用;ELISA检测结果表明,Wip1~(-/-)MSC在PLN中同样促进IFN-α的分泌,且上调促炎因子TNF-α和IL-17a的表达,下调抗炎因子IL-4、IL-10的表达。q-PCR检测小鼠脾脏淋巴细胞IFN家族表达情况,结果显示,Wip1~(-/-)MSC可使小鼠脾脏淋巴细胞中IFN-α、IFN-β及IFN-γ的表达显著上调。结论:Wip1通过调控MSC中BST2-IFN-α的表达影响其免疫调节作用,为阐明MSC治疗T1DM的作用机制提供了新的理论与实验依据。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

图 1. 1 周龄乳鼠基因型鉴定结果1.2.2 Wip1+/+MSC 与 Wip1-/-MSC 的细胞形态提取小鼠骨片细胞，培养 3 天后，细胞换液，倒置显微镜下观察可见Wip1+/+MSC 与 Wip1-/-MSC 分别从骨片中开始爬出，培养至第 3 天时，细胞呈集落样聚集生长（图 2A、图 2D）；当细胞培养至第 3 代，待细胞长满至 80%左右，在显微镜下观察两种 MSC 的形态，可见细胞呈长梭形贴壁生长(图 2B、图 2E)，经 Giemsa 染色后，可见细胞核呈椭圆形，细胞形态为成纤维状，贴壁生长（图2C、图 2F）。

图 1. 1 周龄乳鼠基因型鉴定结果1.2.2 Wip1+/+MSC 与 Wip1-/-MSC 的细胞形态提取小鼠骨片细胞，培养 3 天后，细胞换液，倒置显微镜下观察可见Wip1+/+MSC 与 Wip1-/-MSC 分别从骨片中开始爬出，培养至第 3 天时，细胞呈集落样聚集生长（图 2A、图 2D）；当细胞培养至第 3 代，待细胞长满至 80%左右，在显微镜下观察两种 MSC 的形态，可见细胞呈长梭形贴壁生长(图 2B、图 2E)，经 Giemsa 染色后，可见细胞核呈椭圆形，细胞形态为成纤维状，贴壁生长（图2C、图 2F）。

天津医科大学硕士学位论文图 3. Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 细胞流式鉴定结果A.Wip1+/+MSC 表面抗原表达情况B.Wip1-/-MSC 表面抗原表达情况1.2.4 Wip1+/+MSC 与 Wip1-/-MSC 的成脂诱导分化Wip1+/+MSC 和 Wip1-/-MSC 经成脂诱导 8 天，经油红 O 染色，倒置显微镜下观察，可见两种 MSC 自分化组基本看不到脂滴的存在（图 4A、图 4D），而诱导组可见大量的红色脂滴（图 4B、图 4E）。为进一步证实诱导组具有成脂能力，利用 q-PCR 检测成脂关键的转录因子 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表达，结果表明，两种 MSC 诱导组 PPAR-γ 和 CEBP/α 的表达均显著高于自分化组（图 4C、图 4F）。
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本文编号：2877508