IL-10修饰的内皮祖细胞对非增生期糖尿病视网膜病变发展的影响和分子机制的研究

发布时间：2020-11-12 06:41

　　 目的:本研究通过建立过表达IL-10的EPCs,明确IL-10对EPCs生物学特征的影响;研究IL-10修饰的EPCs对非增生期糖尿病视网膜病变病情的影响,并探讨其作用途径。方法:(1)采用密度梯度离心法提取出生后7天~9天的雄性Wistar大鼠骨髓中的单个核细胞,将其接种培养于预先使用纤维连接蛋白包被的培养板中;培养7天后,利用Dil标记的乙酰低密度脂蛋白(Dil-ac LDL)和FITC标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-I)双标免疫荧光细胞化学染色法,以及FITC标记的血管性血友病因子(FITC-v WF)、PE标记的血管内皮生长因子受体2(PE-VEGFR2)免疫荧光细胞化学染色法鉴定EPCs。并将慢病毒包装的IL-10质粒(EPC-LV-IL-10-GFP)或空白质粒感染EPCs(EPC-LV-NC-GFP),感染48~72小时后荧光显微镜下观察感染效率,并采用流式细胞仪、Transwell法、成管能力和粘附能力实验检测观察各组细胞的细胞周期、迁移、成管和粘附功能。采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测量各组细胞培养基中多种炎性因子的表达量。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定各组细胞中信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路中相关因子表达的变化。(2)雄性成年Wistar大鼠240只,随机分为正常对照组(40只)和实验组(200只)。实验组采用腹腔一次性注射链脲佐菌素建立糖尿病视网膜病变模型,造模成功后3个月时,实验组大鼠随机分为糖尿病对照组(40只)、实验治疗组(EPC-IL-10-GFP)(80只),实验对照组(EPC-NC-GFP)(80只)。同时按照第(1)部分的方法制备EPC-LV-IL-10-GFP和EPC-LV-NC-GFP。正常对照组、糖尿病对照组不给予任何干预;实验治疗组给予EPC-LV-IL-10-GFP(1×105/100μL)鼠尾静脉注射;实验对照组给予等量EPC-LV-NC-GFP鼠尾静脉注射。干预后2周时处死大鼠摘除眼球,行免疫组织化学法分析大鼠视网膜中绿色荧光蛋白的表达,并行视网膜荧光染色铺片检查大鼠视网膜血管的渗漏情况。并于干预后1周、2周及4周时应用伊文思蓝(evans blue,EB)定量检测血视网膜屏障的破坏程度,并处死大鼠摘除眼球行HE染色和枸橼酸铅染色,荧光显微镜和透射电子显微镜下观察视网膜病理组织学改变。(3)雄性成年Wistar大鼠48只,按照第(2)部分的分组和方法制备动物模型并给予同样的干预。在干预后2周处死大鼠摘除眼球,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)和Western Blot测定视网膜中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、血管生成素1(angiopoietin-1,Ang-1),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、金属蛋白酶9(matrix metallproteinases-9,MMP-9)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素6(interleukin 6)、IL-10、核因子κB(nuclear factorkappa B,NF-κB)、核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor kappa-B,IκB)及核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase,IKK)m RNA水平及蛋白水平的表达变化。结果:(1)正常细胞组中,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间细胞粘附、迁移和成管能力无显著性差异(F=1.414,1.817,0.025,P=0.25,0.169,0.976),各组细胞分布于G1期、S期、和G2期的比例基本相同;培养基中加入重组大鼠TNF-α诱导后,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间细胞粘附、迁移和成管能力有显著性差异(F=8.260,135.903,13.246,P=0.001,0,0.011)。EPC-LV-IL-10-GFP组细胞粘附、迁移及成管能力较其他两组显著增加,差异均有统计学意义(P=0.001,0.001;0,0;0.013,0.009)。(2)ELISA检测:正常细胞组中,EPC组、EPC-LV-IL-10-GFP组和EPC-LV-NC-GFP组间培养基中TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF浓度比较,差异均有统计学意义(F=28.910,14.242,10.795,26.097,P=0,0,0.002,0);EPC-LV-IL-10-GFP组与EPC组、和EPC-LV-NC-GFP组相比,TNF-α和IL-8的浓度明显下降(P=0,0;0.002,0.001);IL-10和VEGF的浓度明显升高(P=0.012,0.025;0,0),差异均有统计学意义。培养基中加入重组大鼠TNF-α诱导后TNF-α、IL-10、IL-8和VEGF浓度检测结果与以上结果相似,差异均有统计学意义(F=52.734,5.16,10.067,28.157,P=0,0.024,0.003,0);EPC-LV-IL-10-GFP组与EPC组、和EPC-LV-NC-GFP组相比,TNF-α和IL-8的浓度明显下降(P=0,0;0.002,0.002);IL-10和VEGF的浓度明显升高(P=0.012,0.025;0,0),差异均有统计学意义。(3)与EPC组和EPC-LV-NC-GFP组相比,EPC-LV-IL-10-GFP组中细胞VEGF、MMP-9和p-STAT3的蛋白表达明显增加,而STAT3的蛋白表达下降。(4)给药后2周,GFP在正常对照组及糖尿病对照组视网膜组织中呈阴性表达;在EPC-NC-GFP组和EPC-IL-10-GFP组均呈阳性表达。HE染色结果表明:糖尿病对照组大鼠视网膜各层组织变薄,内界膜水肿,表面欠光滑,神经节细胞层及内核层细胞数量有所降低且神经节细胞排列不整齐,神经上皮层内偶尔可见异常的毛细血管;给药后实验对照组和实验治疗组大鼠视网膜组织内界膜水肿减轻,神经节细胞排列较糖尿病对照组整齐,尤其在给药后2周效果显著,并可维持至给药后4周。视网膜超微结构显示:糖尿病对照组视网膜毛细血管基底膜明显增厚,管腔变窄几乎阻塞,内膜有断裂,Bruch膜增宽,血管基底膜失去窗孔样结构。给药后实验对照组及实验治疗组视网膜内管腔闭塞的小血管数量减少,管腔通畅的血管数量增多,在同一根血管内即可见到退行性改变的内皮细胞又可见到健康的内皮细胞,尤其在实验治疗组中可见视网膜小血管充盈程度提高,部分小血管通畅,一些小血管似有新生。(5)干预后2周,EB血管灌注造影视网膜铺片结果显示:正常对照组大鼠视网膜血管结构清晰,未见荧光渗漏;DM组大鼠视网膜血管弥漫性渗漏呈高荧光改变,局部血管迂曲、节段性扩张;EPC-NC-GFP组大鼠视网膜血管弥漫性渗漏也明显减轻,但血管局部高荧光渗漏多于治疗组;EPC-IL-10-GFP组大鼠视网膜血管弥漫性渗漏明显减轻,血管迂曲扩张不明显,仅见血管局部呈高荧光渗漏。治疗后1周,2周和4周组间EB平均渗漏量比较,差异均有统计学意义(F=35.316,95.734,101.608,P=0,0,0)。治疗后不同时间点组间比较,糖尿病对照组EB平均渗漏量较正常对照组明显增加(P=0,0,0),EPC-IL-10-GFP组、EPC-NC-GFP组EB平均渗漏量较糖尿病对照组降低,差异均有统计学意义(P=0,0,0;0,0,0)。治疗后1周EPC-IL-10-GFP组和EPC-NC-GFP组EB平均渗漏量差异无统计学意义(P=0.833);治疗后2周和4周EPC-IL-10-GFP组EB平均渗漏量较EPC-NC-GFP组降低,差异均有统计学意义(P=0.033,0.043)。(6)Western Blot结果显示:TNF-α、IL-6、IKK-β、P65、i NOS和VEGF在糖尿病对照组中蛋白表达升高,在实验对照组和实验治疗组中表达均降低,尤其在实验治疗组中表达最低,差异均有统计学意义;IL-10、IκB-α和e NOS的蛋白表达与之相反,在糖尿病对照组中表达降低,在实验对照组和实验治疗组中表达升高,尤其在实验治疗组中表达最高,差异均有统计学意义。MMP-9和Ang-1在糖尿病对照组、实验对照组和实验治疗组中蛋白表达均升高,差异无统计学意义。RT-PCR结果显示VEGF、Ang-1、MMP-9、i NOS和e NOS m RNA水平变化与蛋白表达水平变化趋势一致。结论:(1)过表达的IL-10对EPCs生物学特性无明显影响,且过表达的IL-10可以通过激活STAT3信号通路,改善TNF-α诱导下的细胞生物学功能。(2)IL-10修饰的EPCs可以成功转染至视网膜组织,可能通过抑制NF-κB信号通路改善视网膜局部炎性微环境并增强EPCs功能,延缓了非增生期糖尿病视网膜病变的发展。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R774.1;R587.2
【部分图文】：

液去除未贴壁的细胞或者死细胞后，已贴壁的细胞快速增殖，培养至 6-7 天时，显微镜下可见梭型细胞明显增加，细胞呈集落状生长。(图 1.6B)。图1.6 显微镜下观察EPCs。A示为细胞呈短梭型或多角形（×200）；B示典型的细胞集落形成（×100）1.2.1.2 细胞表面标志物 FITC-vWF 的鉴定培养第 7 天的细胞经免疫荧光化学染色法染色后，在荧光倒置显微镜下观察，细胞核结合 DAPI 后呈蓝色荧光（图 1.7A），细胞表面抗原结合 FITC-vWF后呈绿色荧光（图 1.7B），染色的细胞均为分化的 EPCs（图 1.7C）。图 1.7 培养第 7 天时 EPCs 结合 FITC-vWF 表型鉴定（×100）。A 示为细胞核结合 DAPI 后呈蓝色；B 示结合 FITC-vWF 后呈绿色荧光；C 示双染结合的 EPCs

显微镜下可见梭型细胞明显增加，细胞呈集落状生长。(图 1.6B)。图1.6 显微镜下观察EPCs。A示为细胞呈短梭型或多角形（×200）；B示典型的细胞集落形成（×100）1.2.1.2 细胞表面标志物 FITC-vWF 的鉴定培养第 7 天的细胞经免疫荧光化学染色法染色后，在荧光倒置显微镜下观察，细胞核结合 DAPI 后呈蓝色荧光（图 1.7A），细胞表面抗原结合 FITC-vWF后呈绿色荧光（图 1.7B），染色的细胞均为分化的 EPCs（图 1.7C）。

天津医科大学博士学位论文 一、过表达的 IL-10 对大鼠骨髓起源的 EPCs 生物学特性的影响1.2.1.3 细胞表面标志物 PE-VEGFR2 的鉴定培养第 7 天的细胞经免疫荧光化学染色法染色后，在荧光倒置显微镜下观察，细胞核结合 DAPI 后呈蓝色荧光（图 1.8A），细胞表面抗原结合 PE-VEGFR2后呈红色荧光（图 1.8 B），染色的细胞均为分化的 EPCs（图 1.8C）。
【共引文献】

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本文编号：2880397