CKIP-1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

发布时间：2020-11-14 04:29

　　 目的:本实验通过维甲酸干预来诱导大鼠的骨质疏松(Osteoporosis,OP)模型,观察研究模型大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)与正常大鼠BMSCs成骨能力的差异,检测酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)在两组BMSCs中的动态表达,并通过RNA干扰技术(RNAi)降低骨质疏松BMSCs中CKIP-1的表达,探索CKIP-1在调控骨质疏松BMSCs成骨能力的作用,为靶向基因治疗骨质疏松牙槽骨缺损提供分子学理论依据。方法:(1)大鼠骨质疏松模型的建立与验证:取12周龄SD大鼠20只,随机分为两组,骨质疏松组利用维甲酸灌胃法,快速建立骨质疏松模型,正常组灌以等体积生理盐水。灌胃两周后骨密度仪检测两组大鼠骨密度值(Bone Mineral Density,BMD);处死大鼠,取两组大鼠双侧股骨近骺端骨组织,进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin stainng,HE),镜下观察两组大鼠骨小梁变化,验证骨质疏松模型建立成功。(2)BMSCs的分离培养和鉴定:分离两组大鼠四肢,冲出骨髓,采用全骨髓贴壁法培养两组大鼠BMSCs,加入2ml 20%DMEM/F12培养液,置于37~0C、5%CO_2饱和湿度培养箱中培养,观察原代细胞形态,取P3代细胞进行姬姆萨染色;选择对数生长期细胞完成细胞增殖实验并且绘制生长曲线,观察两组大鼠BMSCs增殖能力的差异;流式细胞术检测两组BMSCs表面标志物CD90、CD44、CD34,对两组BMSCs进行成骨诱导21 d后茜素红染色,观察钙结节形成情况;成脂诱导28 d后油红“O”染色并进行油红“O”吸光度(OD)值半定量测定,观察脂滴形成情况,证明BMSCs的多向分化潜能。(3)正常和骨质疏松大鼠BMSCs成骨能力的对比研究:对正常和骨质疏松大鼠BMSCs进行成骨诱导,诱导21 d后茜素红染色比较两组BMSCs钙结节形成数量和大小;诱导14 d后碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)染色,诱导7 d和14 d酶标仪检测ALP活力,比较两组BMSCs的ALP分泌情况;两组BMSCs成骨诱导0、3、7、10、14 d,RT-PCR检测CKIP-1的动态表达;成骨诱导10 d后RT-PCR检测成骨相关基因骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达差异。(4)沉默CKIP-1基因对骨质疏松大鼠BMSCs成骨能力的影响:使用RNAi技术下调骨质疏松BMSCs中CKIP-1的表达,设骨质疏松+空载组(OP+negative control,OP+NC),骨质疏松+沉默组(OP+CKIP-1~-),正常+空载组(Normal+NC),慢病毒转染72 h镜下观察转染情况,RT-PCR验证转染效率;转染后选择对数生长期细胞完成细胞增殖实验;取转染后的三组细胞进行成骨诱导,诱导21 d后茜素红染色,大体及镜下观察转染后三组BMSCs钙结节形成数量和大小;诱导14 d后ALP染色,诱导14 d酶标仪检测ALP活力,比较转染后三组BMSCs的ALP分泌情况;成骨诱导10 d后RT-PCR检测成骨相关基因OPN、Runx的表达情况。结果:(1)成功建立大鼠骨质疏松模型:骨密度结果显示正常组为0.46±0.06 g/cm~2,骨质疏松组骨密度值为0.41±0.03 g/cm~2,骨质疏松大鼠骨密度值明显低于正常组(P﹤0.05);大鼠双侧股骨近骺端骨组织HE染色结果显示骨质疏松组骨量明显少于正常组。(2)BMSCs的成功分离培养及鉴定:全骨髓贴壁法原代培养两组BMSCs第5 d,细胞多呈星型,多角型,细胞集落样生长,P3代细胞姬姆萨染色显示细胞呈短梭形为主;细胞增殖速度快,前7 d两组细胞增殖能力无明显差异,第9 d时骨质疏松组增殖能力强于正常组(P﹤0.05),两组BMSCs均阳性表达CD90与CD44,阴性表达CD34;成骨和成脂诱导后均见钙结节和脂滴形成,油红“O”的OD值骨质疏松组高于正常组(P﹤0.05)。(3)骨质疏松组BMSCs成骨能力检测结果:成骨诱导21 d,与正常组相比,骨质疏松组BMSCs钙结节形成数量少,面积小;成骨诱导14 d,正常组ALP染色块状深染颗粒比骨质疏松组多,染色深,ALP活力亦强于骨质疏松组(P﹤0.05);CKIP-1动态表达结果显示骨质疏松组BMSCs CKIP-1表达水平总体高于正常组;成骨诱导10 d,骨质疏松组BMSCs成骨相关基因OPN,Runx2的mRNA相关水平均低于正常组(P﹤0.05)。(4)沉默CKIP-1基因后骨质疏松+沉默组BMSCs成骨能力检测结果:慢病毒转染后,骨质疏松+沉默组CKIP-1的mRNA表达量明显低于骨质疏松+空载组(P﹤0.05);由生长曲线看出慢病毒对细胞增殖能力无明显影响;成骨诱导21 d,骨质疏松+沉默组和正常+空载组钙结节形成比骨质疏松+空载组数量多,面积大,ALP染色和ALP活力检测均支持这一结果;成骨诱导10 d,与骨质疏松+空载组相比,骨质疏松+沉默组的成骨相关基因OPN,Runx2显著性增高,差异有统计学差异(P0.05),但仍低于正常+空载组。结论:(1)维甲酸诱导的骨质疏松模型BMSCs较正常组增殖能力增强,成骨能力降低,成脂能力升高。(2)沉默CKIP-1基因可以部分提高骨质疏松BMSCs的成骨分化能力。
【学位单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R580
【部分图文】：

图 1-2 大鼠股骨干骺端骨组织 HE 染色(AB×40，CD×100)：A.C：正常组；B.D：骨质疏松组.Fig. 1-2 HE staining of the rat femoral metaphysis (AB×40,CD×100):A.C: the normal group; B.D: thosteoporosis group1.3 讨论经典的去势大鼠骨质疏松模型，通过切除双侧卵巢，引起雌激素水下降，从而影响骨改建平衡过程，破骨细胞增加的同时成骨细胞形成减少造成严重的骨量丢失，最终导致骨质疏松的发生；但该模型构建 3 个月才能得到稳定的骨质疏松模型，造模时间长[30]。目前，维甲酸是恶性肿和白血病的有效治疗的药物，但其在治疗过程中有一个不良反应，就是造成急性骨质疏松的发生，与糖皮质激素引起的骨质疏松模型类似，全给予维甲酸会引起全身的骨骼骨量丢失，从而导致骨质疏松。维甲酸干

CKIP-1 调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究 2019 硕士学位论文2.2 结果分析2.2.1 细胞形态学观察（原代和传代培养）正常组和骨质疏松组 BMSCs 原代培养第 5 d，镜下观察细胞多呈星型多角型，细胞集落样生长，见图 2-1A 和 2-1B，之后细胞继续生长，约 13即可汇合成80%；传3代BMSCs姬姆萨染色显示对照组细胞呈短梭形为主排列成漩涡状和放射状，见图 2-1C；骨质疏松组姬姆萨染色结果显示细胞形态与正常组基本一致，见图 2-1D。

图 2-3 正常组和骨质疏松组 BMSCs 表面抗原表达Fig. 2-3 Surface antigens expression of BMSCs in the normal group and the osteoporosis group2.2.4 BMSCs 多向分化结果2.2.4.1 成骨诱导分化BMSCs 成骨诱导 21 d 后，细胞呈铺石路样生长，间质间见钙盐沉积形成钙结节，茜素红染色后钙结节呈橘红色；正常组钙结节数量多，见图 2-4A，骨质疏松组钙结节数量少，见图 2-4B。
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本文编号：2883077